原發(fā)性干燥綜合征B細(xì)胞亞群特點(diǎn)及B細(xì)胞功能研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述：
　　第一部分 原發(fā)性干燥綜合征B細(xì)胞亞群特點(diǎn)及其調(diào)節(jié)功能研究
　　目的：
　　通過(guò)分析pSS患者B細(xì)胞亞群的主要變化及活化情況，Breg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞分化的調(diào)控影響，在唇腺組織中的表達(dá)情況，濾泡輔助T細(xì)胞(T follicular helper,Tfh)能否促進(jìn)Breg細(xì)胞活化，以及Breg細(xì)胞與pSS患者臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，以期能夠?qū)reg細(xì)胞在pSS發(fā)病機(jī)制中的作用做以初步闡釋。

2、r>　　方法：
　　分離pSS患者和HC外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞表面染色分析B細(xì)胞亞群比例變化，分析pSS患者B細(xì)胞亞群相關(guān)活化因子表達(dá)差異，利用流式細(xì)胞儀分選B細(xì)胞亞群進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。利用免疫組化和免疫熒光方法，對(duì)pSS患者和HC中CD20、IL-10表達(dá)情況進(jìn)行定性、半定量及共定位分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)pSS患者和HC中Tfh、Tfh-IL-21和Breg-IL-21R表達(dá)情況，初步闡釋IL-21對(duì)Breg細(xì)胞的調(diào)控作用。

3、r>　　結(jié)果：
　　1.pSS患者外周血Breg細(xì)胞占CD19+B細(xì)胞比例(9.23±0.45％)，較HC(2.55±0.16％)顯著升高(p＜0.001);成熟B細(xì)胞比例(63.72±1.08％)，較HC(56.50±1.14％)顯著升高(p＜0.001);記憶性B細(xì)胞比例(6.34±0.46％)，較HC(19.36±1.03％)顯著降低(p＜0.001); CD19+CD24hiCD27+細(xì)胞比例(6.05±0.53％)，較H

4、C(16.39±1.15％)顯著降低(p＜0.001)。B細(xì)胞三個(gè)主要亞群在形態(tài)學(xué)上無(wú)顯著性差異。
　　2.pSS患者Breg細(xì)胞表面分子CD80、CD44、CD95、TACI表達(dá)水平較記憶性B細(xì)胞顯著下降(p＜0.05);
　　3.pSS患者CD19+B細(xì)胞表達(dá)IL-10水平為(8.23±1.91％)，較HC(25.55+0.63％)顯著降低(p＜0.001); Breg細(xì)胞IL-10表達(dá)水平為(28.43+5.49％)，

5、較HC(53.13+7.93％)顯著降低(p=0.030)。
　　4.進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和交叉培養(yǎng)，培養(yǎng)上清檢測(cè)結(jié)果提示:相較與HC，pSS患者的Breg細(xì)胞不能有效抑制其本身或HC的效應(yīng)T細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17、IL-21以及IL-9(p＜0.05)。
　　5.在pSS患者的唇腺組織中可見(jiàn)大量CD20+B細(xì)胞浸潤(rùn)，而IL-10表達(dá)較少，且與HC的IL-10+細(xì)胞在唇腺組織中的

6、分布部位存在差異，免疫熒光染色提示pSS患者唇腺組織中僅見(jiàn)少量散在CD20+IL-10+細(xì)胞表達(dá)。
　　6.pSS患者外周血Tfh細(xì)胞比例（占CD4+T細(xì)胞）為(21.88±0.82％)，較HC(17.91±0.88％)顯著升高(p=0.002);且CD4+CXCR5+PD-1+細(xì)胞（占CD4+T細(xì)胞）(7.42±0.80％)及CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞水平(19.41±0.91％)亦較HC(1.71±0.12％，16.2

7、9±0.84％)顯著增多(p＜0.001，p=0.016)。pSS患者Tfh細(xì)胞IL-21表達(dá)水平(27.43±2.94％)，較HC(9.97±1.91％)顯著升高(p=0.018)。pSS患者Breg細(xì)胞IL-21R的表達(dá)(62.27±2.43％)，較HC(75.25±2.18％)顯著降低(p＜0.001)。
　　7.分離pSS患者和HC的CD19+B細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在加入CD40L和CpG基礎(chǔ)上，增加/不增加rh IL-21

8、刺激，觀察Breg細(xì)胞IL-10表達(dá)。體外培養(yǎng)過(guò)程中rh IL-21可以顯著提高pSS患者和HC的Breg細(xì)胞IL-10表達(dá)(p＜0.05)，提示在體內(nèi)可能有其他因素影響IL-21對(duì)Breg細(xì)胞的調(diào)控。
　　8.在ESR升高、IgG升高、抗SSA抗體陽(yáng)性、抗SSB抗體陽(yáng)性、ESSDAI評(píng)分提示病情活動(dòng)的pSS患者Breg細(xì)胞比例顯著升高。Breg細(xì)胞比例與pSS患者ESR、IgG水平呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　與HC相

9、比，pSS患者外周血B細(xì)胞亞群存在顯著性偏倚，Breg細(xì)胞比例顯著增加，記憶性B細(xì)胞比例顯著減低，Breg細(xì)胞表面活化因子表達(dá)與記憶性B細(xì)胞存在差異。pSS患者雖然Breg細(xì)胞比例增多，但I(xiàn)L-10的表達(dá)卻顯著下降，且不能有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子。pSS患者Breg細(xì)胞在唇腺組織中表達(dá)未見(jiàn)明顯增多，不能有效抑制和局限炎癥反應(yīng)。pSS患者體內(nèi)由于Breg細(xì)胞IL-21R表達(dá)顯著下降，Tfh細(xì)胞分泌IL-21未能有效促進(jìn)Breg細(xì)

10、胞抑制功能的發(fā)揮。pSS患者Breg細(xì)胞比例與IgG、ESR、抗SSA/抗SSB抗體以及ESSDAi評(píng)分相關(guān)。
　　第二部分 轉(zhuǎn)錄組與microRNA聯(lián)合分析原發(fā)性干燥綜合征B細(xì)胞活化特點(diǎn)
　　目的：
　　利用RNA-seq技術(shù)對(duì)pSS患者外周血B細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并與健康對(duì)照者(healthy control，HC)對(duì)比進(jìn)行基因差異表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路分析，利用miRNA測(cè)序結(jié)果初步篩選可能參與B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的miR

11、NA，同時(shí)將兩者結(jié)合分析，有效篩選出miRNA可能靶基因位點(diǎn)。
　　方法：
　　入組3例pSS患者和3例性別年齡匹配的HC。分離pSS患者和HC的外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用磁珠分選CD19+B細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)不同需要，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組和miRNA測(cè)序所需的cDNA文庫(kù)，利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)比對(duì)分析，篩選出pSS患者和HC間差異表達(dá)基因和差異表達(dá)miRNA，利用GO注釋和KEGGpathway進(jìn)行富集，分析這

12、些差異表達(dá)基因或靶基因可能的生物學(xué)功能，在pSS發(fā)病中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)錄組分析中，將pSS患者和HC的B細(xì)胞樣本進(jìn)行比對(duì)分析，共篩選出51個(gè)差異表達(dá)上調(diào)基因和22個(gè)差異表達(dá)下調(diào)基因。這些基因多集中于微生物感染相關(guān)的信號(hào)通路上，如流感病毒A、丙型肝炎病毒、麻疹病毒和單純皰疹病毒感染等途徑上。
　　2.在miRNA分析中，將pSS患者和HC的B細(xì)胞樣本進(jìn)行比對(duì)分析，共篩選出5個(gè)具有顯著性差異表達(dá)miRNA，

13、其中1個(gè)表達(dá)上調(diào)，4個(gè)表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及功能通路分析發(fā)現(xiàn)，其顯著富集于單純皰疹病毒感染、TGF-β等信號(hào)通路上。
　　3.將差異表達(dá)基因和差異表達(dá)miRNA進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選出miRNA可能的靶基因。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和miRNA聯(lián)合分析，在pSS患者外周血B細(xì)胞中篩選出51個(gè)差異表達(dá)上調(diào)和22個(gè)差異表達(dá)下調(diào)的基因。這些上調(diào)差異表達(dá)基因主要集中于IFN相關(guān)信號(hào)通路及病毒感染有

14、關(guān)通路上，有可能是外界病毒等微生物感染觸發(fā)了IFN信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終導(dǎo)致B細(xì)胞的活化增殖。篩選出5個(gè)具有顯著性差異表達(dá)的miRNA，靶基因主要集中于對(duì)B細(xì)胞結(jié)構(gòu)和核酸修飾合成等方面，說(shuō)明pSS患者一些基因的差異表達(dá)，miRNA只是其中一種調(diào)控方式。
　　第三部分 原發(fā)性干燥綜合征B細(xì)胞受體庫(kù)差異表達(dá)研究
　　目的：
　　利用高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)患者和健康人B細(xì)胞的BCR CDR3受體庫(kù)進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，評(píng)估p

15、SS患者機(jī)體BCR CDR3受體庫(kù)的組成、多樣性、各功能基因亞家族的偏向取用和健康人群可能存在的差異。
　　方法：
　　提取20例pSS患者和19例性別年齡匹配的健康對(duì)照者(healthy controls，HC)外周血單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選CD19+B細(xì)胞，提取基因組DNA，進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，2％瓊脂糖凝膠回收，上機(jī)測(cè)序，獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行生物學(xué)分析。
　　

16、結(jié)果：
　　1.pSS患者CDR3序列平均長(zhǎng)度為(53.03±1.68) bp，顯著低于健康對(duì)照組(55.47±1.52) bp(p＜0.001)。
　　2.對(duì)pSS患者和健康對(duì)照者CDR3多樣性比較分析發(fā)現(xiàn)，反映免疫組庫(kù)多樣性的D50指數(shù)在pSS患者中為(0.217±0.014)顯著低于HC(0.229±0.020)(p=0.04)，說(shuō)明疾病組CDR3克隆多樣性較對(duì)照組明顯下降。
　　3.pSS患者和健康對(duì)照者V/J

17、基因優(yōu)勢(shì)取用分析:pSS患者在V功能性家族性基因中，對(duì)IGHV1、IGHV4、IGHV5、IGHV6的取用率顯著高于健康對(duì)照者，對(duì)IGHV3的取用率顯著低于健康對(duì)照者;pSS患者在J功能性家族性基因中，對(duì)IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3的取用率顯著高于健康對(duì)照者(p＜0.05)。
　　4.在BCR CDR3受體庫(kù)基礎(chǔ)上篩選出普遍存在于抗SSB抗體陽(yáng)性pSS患者外周血B細(xì)胞BCR H鏈的優(yōu)勢(shì)取用CDR3序列，進(jìn)一步與健康對(duì)照組比較

18、，發(fā)現(xiàn)3種與疾病特征性相關(guān)的Share克隆型。
　　結(jié)論：
　　pSS患者BCR CDR3序列長(zhǎng)度和多樣性顯著低于HC，提示pSS患者中某些B細(xì)胞存在特異性克隆擴(kuò)增可能。pSS患者BCR CDR3的功能基因亞家族V/J基因取用具有偏向性，這些非隨機(jī)優(yōu)勢(shì)取用可能與某些特異性克隆相關(guān)。關(guān)于BCR CDR3受體庫(kù)的進(jìn)一步深入研究，將有助于發(fā)現(xiàn)pSS患者疾病相關(guān)B細(xì)胞克隆，監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)下B細(xì)胞活化狀態(tài)，尋找潛在的pSS特異性自身抗原