維生素E干預(yù)激素性股骨頭壞死的作用與相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、目的：在建立激素性股骨頭壞死動物模型的基礎(chǔ)上，從組織形態(tài)學及細胞分子的水平，研究維生素E對于激素性股骨頭壞死早期骨細胞凋亡、骨髓造血細胞DNA氧化損傷的影響及不同劑量維生素E對激素性股骨頭壞死細胞凋亡的影響，探討維生素E干預(yù)激素性股骨頭壞死的作用及相關(guān)機制，為臨床預(yù)防及治療激素型股骨頭壞死提供相關(guān)思路。
　　方法：
　　一、維生素E對激素性股骨頭壞死早期骨細胞凋亡、骨髓造血細胞DNA氧化損傷的影響
　　1．選健康中國大

2、耳白兔36只,隨機將其分為3組。模型組(model group)，12只，耳緣靜脈內(nèi)注射10μg/Kg脂多糖，24h后于右側(cè)臀肌注射20mg/Kg甲基強的松龍，總共3次，每次間隔24小時。維生素E組(vitamin E group)，12只，耳緣靜脈內(nèi)注射10μg/Kg脂多糖，24h后于右側(cè)臀肌注射20mg/Kg甲基強的松龍，總共3次，每次間隔24小時。于造模開始之日飼予維生素E，0.6g/Kg/d。對照組(control group)

3、：同前兩組在相同時間點用同樣的方法注射等量的生理鹽水。每組實驗動物均肌內(nèi)注青霉素，劑量80萬u/只，每周兩次，以預(yù)防感染。觀察各組動物的一般狀況（如精神狀態(tài)、食欲情況、體重變化等），制模完成后4周和6周，采用空氣栓塞法各組分別處死6只，在相對無菌條件下取雙側(cè)股骨頭常規(guī)固定脫鈣、包埋，切片待測。
　　2.在顯微鏡下對各組標本行組織形態(tài)學觀察，蘇木精—伊紅染色(HE)光鏡下計數(shù)空缺骨陷窩。
　　3.采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（TUN

4、EL）染色法分析各組股骨頭組織中骨細胞凋亡情況，計數(shù)凋亡指數(shù)。
　　4.采用免疫組織化學鏈菌素抗生物素蛋白一過氧化物酶(SP)法檢測各組股骨頭組織第4周凋亡基因相關(guān)蛋白bcl-2、bax和caspase-3的表達；并采用實時熒光定量PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應(yīng))法分析3組兔股骨頭組織中bcl-2、bax和caspase-3 mRNA水平；
　　5.利用免疫組織化學法檢測各組標本第

5、4周骨髓造血細胞DNA氧化損傷。
　　二、不同劑量維生素E對激素性股骨頭壞死早期骨細胞凋亡的影響
　　1.動物75只，分為5組，模型組，15只，造模方法同上。維生素E組，共45只，分為高劑量組(high-dose group of vit E)（1.2g/Kg/天）、中劑量組(middle-dose group of vit E)（0.6g/Kg/天）、低劑量組(low-dose group of vit E)（0.3g/K

6、g/天）劑量組，每組15只，同模型組方法造模。并于造模開始之日飼以不同劑量的維生素 E。對照組，15只，于相同時間點注射等量的生理鹽水。觀察各組實驗動物的一般狀況，制模完成后4周、6周和8周，分批取材。
　　2.行組織形態(tài)學觀察及HE染色光鏡下計數(shù)各組空缺骨陷窩。
　　3.采用TUNEL法檢測各組骨細胞凋亡情況，計數(shù)凋亡指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1．組織病理學觀察(HE)
　　模型組：骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、稀疏變細

7、、骨細胞大量減少，空骨陷窩增加；維生素E組：中、低劑量組：骨小梁結(jié)構(gòu)欠規(guī)則，排列較稀疏，雜亂?？展窍莞C較多。高劑量組：骨小梁結(jié)構(gòu)基本完整，可見少許空骨陷窩。對照組骨小梁結(jié)構(gòu)完整，排列致密有序，成骨細胞核大且位于中央。模型組的空骨陷窩率均高于維生素 E組(P＜0.05)，模型組及維生素E組的空骨陷窩率均高于對照組(P＜0.05)；維生素E高劑量組的空骨陷窩率均低于中、低劑量組(P＜0.05)。
　　2．細胞凋亡檢測(TUNEL)

8、r>　　模型組的骨細胞凋亡指數(shù)均高于維生素E組(P＜0.05)，模型組及維生素E組的骨細胞凋亡指數(shù)均高于對照組(P＜0.05)；維生素E高劑量組的骨細胞凋亡指數(shù)均低于中、低劑量組(P＜0.05)。
　　3.免疫組織化學法檢測結(jié)果
　　制模后4周，模型組bcl-2陽性細胞率減少，bax、caspase-3陽性細胞率增加，與對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。維生素E組bcl-2陽性細胞率較模型組增加，低于對照組（P＜0.0

9、5），bax、caspase-3陽性細胞率較激素模型組減少，高于對照組（P＜0.05）。
　　4.骨髓造血細胞DNA氧化損傷結(jié)果
　　制模后第4周時，維生素E組骨髓造血細胞DNA氧化損傷率低于模型組，高于對照組(P＜0.05)。
　　5.PCR結(jié)果
　　第4周取材時，與維生素E組比較，模型組股骨頭組織中bcl-2 mRNA水平下降（P＜0.05），bax和caspase-3mRNA和蛋白質(zhì)水平升高（P＜0.05）

10、。模型組、維生素E組與對照組相比，標本中bax和caspase-3 mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高，而bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.維生素E各組之間比較，高劑量組在改善骨細胞凋亡方面差異顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1．在激素性股骨頭壞死早期，大劑量激素可能通過抑制bcl-2的表達，促進bax及caspase-3的表達而導(dǎo)致股骨頭發(fā)生缺血壞死。
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