SFRP5和SLURP1相互作用及對(duì)胰島素抵抗作用的研究.pdf

1、第一部分免疫共沉淀篩選SFRP5相互作用蛋白
　　目的：免疫共沉淀篩選SFRP5相互作用蛋白。
　　方法：免疫共沉淀分離SFRP5相互作用蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后銀染，通過與對(duì)照組的比較切割差異蛋白條帶，質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)分析，選取一個(gè)可能與SFRP5相互作用的蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果：成功分離SFRP5相互作用的蛋白質(zhì)，質(zhì)譜檢測(cè)差異銀染條帶篩選出7個(gè)差異蛋白，選取SLURP1為目標(biāo)蛋白。
　　結(jié)論：SLU

2、RP1可能是SFRP5的相互作用蛋白。
　　第二部分驗(yàn)證SFRP5和SLURP1間的相互作用
　　目的：SFRP5和SLURP1蛋白之間相互作用的驗(yàn)證。
　　方法：提取脂肪組織T-RNA，PCR獲的SFRP5和SLURP1基因片段，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA-SFRP5和pCMV-Myc-SLURP1，利用PCR產(chǎn)物大小和DNA測(cè)序結(jié)果鑒定重組質(zhì)粒是否成功，Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。真核表達(dá)載體

3、pCMV-HA-SFRP5和pCMV-Myc-SLURP1共轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞，免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證SFRP5和SLURP1蛋白間相互作用。
　　結(jié)果：真核表達(dá)載體pCMV-HA-SFRP5和pCMV-Myc-SLURP1成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞，HA蛋白抗體沉淀，Myc蛋白抗體檢測(cè)，可見SLURP1的表達(dá)；反之，Myc蛋白抗體沉淀，HA蛋白抗體檢測(cè)，可見SFRP5蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-

4、HA-SFRP5和pCMV-My-c-SLURP1，成功驗(yàn)證 SFRP5和SLURP1間的相互作用。
　　第三部分 SFRP5和SLURP1基因之間的影響和對(duì)胰島素抵抗的作用
　　目的：研究SFRP5和SLURP1基因間的影響和對(duì)胰島素抵抗作用。
　　方法：Q-PCR檢測(cè)SFRP5（SLURP1）基因在小鼠組織中的分布；SFRP5和SLURP1過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染hepG-2細(xì)胞，將細(xì)胞分為正常轉(zhuǎn)染組和高濃度飽和脂肪酸處

5、理組，Q-PCR方法檢測(cè)SFRP5（SLURP1）表達(dá)上調(diào)對(duì)SLURP1（SFRP5）的影響；用構(gòu)建的三個(gè)不同目的片段的pGenesil–SFRP5和pGenesil–SLURP1抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hepG-2細(xì)胞，Q-PCR方法篩選最佳抑制質(zhì)粒；然后用pGenesil–SFRP5和pGenesil–SLURP1的最佳抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hepG-2細(xì)胞，檢測(cè)TG、TC含量變化；同樣用pCMV-HA-SFRP5和pCMV-Myc-SLURP1過表達(dá)質(zhì)

6、粒轉(zhuǎn)染hepG-2細(xì)胞，檢測(cè)TG、TC含量和葡萄糖攝取率（GUR）的變化；檢測(cè)SLURP1基因在3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)變化。
　　結(jié)果：SFRP5和SLURP1基因shRNA的最佳抑制率分別為68％和51.7％；不同小鼠組織均可見SFRP5基因分布，mRNA相對(duì)表達(dá)量由高到低分別為：脂肪、肌肉、腦、心臟、肝臟等；SLURP1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量由高到低分別為：胃、皮膚、動(dòng)脈、肺、心臟、睪丸、肌肉、脂肪等；無處理因素情

7、況下SLURP1和SFRP5過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG-2，SFRP5或SLURP1表達(dá)無變化；SLURP1和SFRP5分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)，然后用棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)，可見SLURP1變化對(duì)SFRP5影響顯著，SFRP5變化對(duì)SLURP1影響效果不明顯。脂肪誘導(dǎo)過程中SLURP1基因表達(dá)升高，第4天達(dá)到峰值；HepG-2細(xì)胞SLURP1基因過表達(dá)，檢測(cè)SREBP-1C、ACC、FAS、SCD-1、HMGR mRNA，SREBP-1C、ACC、

8、FAS表達(dá)降低，HMGR、SCD-1無變化。SLURP1基因過表達(dá)時(shí)TG、TC表達(dá)下降（P<0.05）、糖攝取增加（P<0.05）。SLURP1基因抑制，TG升高（P<0.05）、TC無變化。SFRP5基因過表達(dá)，TG降低（P<0.05）、TC無變化、糖攝取增加（P<0.05）。SFRP5基因抑制，TG升高（P<0.05）、TC無變化。
　　結(jié)論：SLURP1基因過表達(dá)時(shí)可以抑制TG、TC，增加糖攝取。SFRP5基因過表達(dá)時(shí)僅可抑