地塞米松對SNI模型大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機制.pdf

1、背景：
　　糖皮質(zhì)激素既是機體重要的生理物質(zhì)，又是廣泛應(yīng)用于臨床的免疫抑制劑[1,2],而地塞米松（Dexamethasone，Dex）是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)。糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid Receptor，GR）是一種激素依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是核受體超家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)GR廣泛表達于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)傷害性信息的傳遞以及病理性疼痛時中樞痛覺敏化的產(chǎn)生和發(fā)

2、展與GR表達關(guān)系密切[4-6]。
　　神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的一類慢性痛，腫瘤造成的骨壓縮、感染、自身免疫疾病、創(chuàng)傷和糖尿病等均可引起的此類疼痛[7]。除了自發(fā)痛和痛覺過敏的癥狀之外，它還可以誘發(fā)機體對正常無害刺激產(chǎn)生痛覺超敏，即觸誘發(fā)痛[8,9]。研究者已開始逐漸認(rèn)識到神經(jīng)病理性疼痛并不單純是一種癥狀，而是神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂所導(dǎo)致的一個綜合后果[10,11]。因此，探索其痛覺敏化產(chǎn)生的機制對神經(jīng)病理性疼痛的治療顯得尤為重要

3、。
　　近年研究顯示，在外周神經(jīng)損傷模型、癌痛模型以及外周炎性痛模型中，均可觀察到位于脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞不同程度的活化[12-14]。研究表明膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛中具有重要作用，是中樞痛敏發(fā)生和維持的關(guān)鍵性因素[15]。研究發(fā)現(xiàn)，作為絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinases,MAPK)信號通路家族中的一員，p38MAPK在多種神經(jīng)病理性疼痛過程中的活化位置特異性出現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞上[

4、16]。諸多證據(jù)表明脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞 p38MAPK的活化與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展有著密切聯(lián)系[17-19]。
　　地塞米松具有調(diào)節(jié)外周免疫反應(yīng)及對腦組織的抗炎作用，而小膠質(zhì)細(xì)胞也在腦組織的免疫及炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[20]。小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓背角的增生影響神經(jīng)病理性痛過程中神經(jīng)敏化的形成[21]，在體外糖皮質(zhì)激素能夠影響B(tài)V-2小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化[22]。但在體內(nèi)，糖皮質(zhì)激素能否通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞中 p38MAPK信號通

5、路從而影響神經(jīng)病理性痛過程中樞痛敏的形成還未可知。
　　目的：
　　建立SNI大鼠模型，檢測地塞米松和p38抑制劑sb203580給藥前后SNI大鼠機械痛閾的變化，檢測疼痛炎癥因子IL-6釋放的改變，GR和磷酸化p38蛋白表達的變化，證明地塞米松對 SNI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響可能是介導(dǎo)p38MAPK信號通路實現(xiàn)的，并在原代小膠質(zhì)細(xì)胞中，給予地塞米松與sb203580觀察GR、磷酸化p38表達和小膠質(zhì)細(xì)胞活性之間的關(guān)系，從

6、而探討地塞米松對SNI模型大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及可能機制。
　　材料和方法：
　　1.分組：動物實驗中，將大鼠隨機分為分為9組：正常組（Naive組，n=10），模型組（SNI組，n=10）,假手術(shù)組（Sham組，n=10）,地塞米松單純注藥組（D ex組，n=10),地塞米松處理組（SNI+Dex組，n=10),生理鹽水處理組（SNI+NS組，n=10)，SB203580單純注藥組（sb203580組，n=10)，SB20358

7、0處理組（S NI+sb203580組，n=10),SB23580溶質(zhì)二甲基亞砜組（SNI+DMSO組，n=10)；細(xì)胞實驗中，將細(xì)胞分為5組：DPBS組（n=4)，谷氨酸組（GLU組,n=4）,地塞米松處理組（GLU+Dex組,n=4),DMSO處理組（GLU+DMSO組,n=4),SB處理組（GLU+sb203580組,n=4)。
　　2.SNI模型建立：Sham組只暴露坐骨神經(jīng)及其分支但不結(jié)扎。模型組切開大鼠后肢皮膚后，充分

8、暴露坐骨神經(jīng)及其分支，選擇性結(jié)扎并剪斷腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)。
　　3.蛛網(wǎng)膜下腔置管：在 L5-L6間隙穿刺，大鼠出現(xiàn)甩尾、抖動反射時，將PE10導(dǎo)管前端向上置入，導(dǎo)管內(nèi)有清亮的腦脊液流出或大鼠出現(xiàn)甩尾反射，提示蛛網(wǎng)膜下腔置管成功。
　　4.機械痛閾測定：采用Von frey絲測定大鼠50％縮足閾值。
　　5.蛋白印記檢測（Western-blot）：檢測Sham組與SNI組大鼠3天、7天、14天、21天脊髓GR蛋白及磷酸

9、化p38的表達，及其余各組7天脊髓GR蛋白及磷酸化p38的表達情況。
　　6.酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELisa)：檢測各組大鼠7天血清IL-6蛋白的含量。
　　7.原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞后進行小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化并鑒定。
　　8.細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測：檢測各組細(xì)胞GR及CD11b/c的蛋白表達熒光強度。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠機械痛閾結(jié)果顯示：SNI組大鼠術(shù)后7天、14天、21天和28天的50

10、%縮足閾值顯著降低（P<0.05）；建模早期蛛網(wǎng)膜下腔注射 Dex后，SNI+Dex組大鼠術(shù)后7天術(shù)側(cè)50%縮足閾值顯著升高（P<0.05）；后期注射Dex，SNI+Dex組大鼠10天、11天、12天術(shù)側(cè)50%縮足閾值升高（P<0.05）；SNI+sb203580組大鼠7天、9天、11天大鼠50%縮足閾值升高（P<0.05）。
　　2.Western-blot結(jié)果顯示：SNI組術(shù)后7天、14天21天GR表達降低，伴隨術(shù)后3天、7天

11、磷酸化 p38的表達水平升高（P<0.05）；SNI+Dex組大鼠脊髓GR表達水平提高，而p38磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；SNI+sb203580組脊髓磷酸化p38表達水平顯著降低（P＜0.05）但GR表達變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.Elisa結(jié)果顯示：同Sham組相比，SNI組大鼠血清IL-6蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；同SNI組相比，SNI+Dex組與SNI+sb203580組大鼠血清IL-6含

12、量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：GLU組小膠質(zhì)細(xì)胞突起縮短，形態(tài)變圓，呈阿米巴樣，但 GLU+Dex組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)為細(xì)長分支狀；GLU組小膠質(zhì)細(xì)胞中CD11b/c的熒光強度顯著提高（P＜0.05），GLU+Dex組GR熒光強度提高，而小膠質(zhì)細(xì)胞中CD11b/c強度下降；GLU+sb203580組細(xì)胞CD11b/c熒光強度顯著下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　地塞米