MTBP通過(guò)增強(qiáng)MDM2調(diào)節(jié)e-鈣黏蛋白的降解促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移.pdf

1、目的:
　　肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在目前癌癥死亡率中排名第二位，手術(shù)切除是治療肝癌的主要方法[1]。然而，多數(shù)患者從就診到確診為肝癌時(shí)已是中晚期，喪失了根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，僅有不足20％的患者能及時(shí)進(jìn)行根治性的手術(shù)切除。這主要是因?yàn)楦伟┘?xì)胞的惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早、呈快速浸潤(rùn)性生長(zhǎng)所導(dǎo)致的。因此，研究調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的防治靶點(diǎn)已成為肝癌治療領(lǐng)域研究的一個(gè)關(guān)鍵性

2、問(wèn)題[2-3]。
　　最新研究證實(shí)MTBP可影響到腫瘤生長(zhǎng)的許多方面，主要包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及耐藥基因的表達(dá)等。研究發(fā)現(xiàn)MTBP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但其對(duì)肝細(xì)胞癌(HCC)的影響尚不清楚。我們首先發(fā)現(xiàn)MTBP蛋白高表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝癌患者的預(yù)后不良情況相關(guān)。MTBP在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系的表達(dá)與非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系相比增加。與這些發(fā)現(xiàn)一致，MTBP的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移在體外和在體內(nèi)，而利用小干擾RNA片段

3、沉默MTBP導(dǎo)致肝癌遷移和侵襲能力降低。在腫瘤進(jìn)展中，腫瘤細(xì)胞獲得的間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)和丟失的上皮標(biāo)志物的表達(dá)，從而導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和隨后的腫瘤轉(zhuǎn)移。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的下調(diào)被證實(shí)是EMT的標(biāo)志，并有研究報(bào)道與惡性上皮癌的發(fā)展有著密切的關(guān)系。我們前期通過(guò)基因芯片篩選在肝癌細(xì)胞中降低MTBP表達(dá)可導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)升高。肝癌是一種侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤，所以我們推測(cè)MTBP可能通過(guò)調(diào)控E-cadhe

4、rin的表達(dá)從而影響肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究擬先檢測(cè)MTBP在肝癌組織中的表達(dá)并分析在肝癌患者中MTBP的表達(dá)與其生存率相關(guān)性;其次通過(guò)體外和體內(nèi)研究明確MTBP調(diào)控E-cadherin表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響;最后探討MTBP調(diào)控E-cadherin的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1、通過(guò)運(yùn)用RT-PCR、Western blot、免疫組化等方法檢測(cè)120例肝癌組織及癌旁組織MTBP的表達(dá)水平，并運(yùn)用Kap

5、lan-Meier分析MTBP的表達(dá)與肝癌患者和復(fù)發(fā)肝癌患者的生存率的關(guān)系;
　　2、觀(guān)察改變肝癌細(xì)胞中MTBP的表達(dá)，運(yùn)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MTBP蛋白表達(dá)變化，同時(shí)利用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀(guān)察肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化;
　　3、通過(guò)運(yùn)用Western blot等方法檢測(cè)改變肝癌細(xì)胞中MTBP的表達(dá)后E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，以及肝癌組織及癌旁組織MTBP和E-cadhe

6、rin蛋白的表達(dá)水平，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析兩者的相關(guān)性。
　　4、通過(guò)Western blot、免疫共沉淀、激光共聚焦確定MDM2和Ub的相互作用及MTBP如何參與MDM2的泛素化從而降低E-cadherin蛋白表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果:
　　1、qRT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了120例肝癌組織樣本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織MTBP表達(dá)，在肝癌組織中MTBP表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。84(70.0

7、％)例肝癌患者中肝癌組織中MTBP高表達(dá)，而只有12個(gè)(10％)癌旁組織高于癌組織高。我們通過(guò)免疫組化染色的結(jié)果也顯示，在腫瘤組織中的MTBP蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。并通過(guò)Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)MTBP高表達(dá)患者的生存率明顯低于MTBP低表達(dá)患者;
　　2、Western blot、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell和裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)在肝癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞中MTBP的表達(dá)，可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力;

8、干擾肝癌細(xì)胞中MTBP的表達(dá)，可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　3、過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞中MTBP的表達(dá)后E-cadherin蛋白明顯下降，干擾肝癌細(xì)胞中MTBP的表達(dá)后E-cadherin蛋白明顯升高。另外，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢查發(fā)現(xiàn)肝癌組織及癌旁組織MTBP和E-cadherin蛋白的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性。
　　4、通過(guò)免疫共沉淀、激光共聚焦確定MDM2和Ub的相互作用，并證實(shí)MTBP可以通過(guò)調(diào)節(jié)MDM2的泛素