粘脂累積病和先天性眼球震顫相關(guān)致病基因突變分析及功能研究.pdf

1、本文收集并鑒定了一個(gè)粘脂累積病及兩個(gè)先天性眼球震顫家系,通過(guò)連鎖分析(Linkage Analysis)與定位克隆(Positional Cloning)分子遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)這三個(gè)家系進(jìn)行了遺傳學(xué)分析,確定了它們的致病原因。同時(shí)對(duì)一個(gè)功能不清楚的眼球震顫致病基因FRMD7進(jìn)行了初步的功能分析。其結(jié)果如下:
　　1、粘脂累積病家系的分子遺傳學(xué)分析。
　　對(duì)收集和鑒定的一對(duì)夫婦(非近親婚配)生育了三個(gè)粘脂累積病孩子(兩女一男)進(jìn)行微

2、衛(wèi)星標(biāo)記的連鎖分析,發(fā)現(xiàn)GNPTG基因附近的微衛(wèi)星標(biāo)記D16S3024和選擇對(duì)先證者GNPTG基因所有外顯子和外顯子/內(nèi)含子交界處進(jìn)行直接測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了先征者GNPTG基因存在兩個(gè)未報(bào)導(dǎo)的雜合突變(即一個(gè)復(fù)合型雜合突變)IVS4-1G＞C(剪切突變)和c.471delC(單堿基缺失突變)。對(duì)其雙親測(cè)序發(fā)現(xiàn),先征者攜帶的一個(gè)雜合IVS4-1G＞C突變是來(lái)自其母親,而另一個(gè)雜合的c.471delC缺失突變是來(lái)自父親。同時(shí)對(duì)另外的兩位患者進(jìn)行上

3、述兩個(gè)突變位置的測(cè)序檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這兩位患者攜帶與先征者相同的突變。;通過(guò)體外和體內(nèi)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及測(cè)序?qū)嶒?yàn),發(fā)現(xiàn)IVS4-1G＞C突變導(dǎo)致增加第4內(nèi)含子74個(gè)堿基的mRNA的產(chǎn)生,該mRNA翻譯的GNPTG蛋白在第4個(gè)外顯子編碼開(kāi)始處產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子,因此也產(chǎn)生一個(gè)可能無(wú)功能的蛋白。說(shuō)明GNPTG基因的IVS4-1G＞C和c.471delC這個(gè)復(fù)合型雜合突變是導(dǎo)致該家系三個(gè)患者的發(fā)病原因。
　　2、X連鎖先

4、天性眼球震顫家系的分子遺傳學(xué)分析。
　　收集并鑒定了兩個(gè)X-連鎖的先天性眼球震顫家系。家系1的遺傳方式為X-連鎖隱性遺傳,通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記的連鎖分析,發(fā)現(xiàn)不能排除GPR143基因突變是導(dǎo)致該家系眼球震顫的原因,對(duì)先證者GPR143基因所有外顯子和外顯子/內(nèi)含子交界處直接測(cè)序,在該基因編碼框819到822位的四個(gè)堿基(AACA)缺失(c.819_822del),這是一個(gè)新的突變,該突變?cè)斐?GPR143蛋白在274位移碼,移碼7個(gè)氨基

5、酸后產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子(p.T274Ifs*8),產(chǎn)生一個(gè)截短蛋白;運(yùn)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析,家系中所有男性患者和女性攜帶者都存在該突變,而家系外100例(50例男性和50女性)正常人不存在該突變。家系2的遺傳方式為X-連鎖顯性遺傳,先證者及其母親眼球震顫并伴隨頭震顫和斜視等癥狀,根據(jù)這些臨床癥狀不能排除 FRMD7基因突變所致;因此選擇先征者基因組DNA,對(duì)FRMD7基因所有外顯子和外顯子交界處直接測(cè)序,在該基因的580位發(fā)

6、現(xiàn)單個(gè)堿基改變即c.580G＞A(p.A194T);并且該突變存在男性患者和女性患者,且女性患者為雜合突變,不存在于100例(50例男性和50女性)正常人群;通過(guò)生物信息學(xué)氨基酸保守性分析,發(fā)現(xiàn)194位的丙氨酸從線蟲到人類都是高度保守的。以上研究推測(cè)GPR143基因p.T274IfsX7突變和FRMD7基因c.580G＞A(p.A194T)突變分別是導(dǎo)致眼球震顫家系1和家系2的致病原因。
　　3、眼球震顫致病基因 FRMD7初步的

7、功能分析。
　　為了初步探討FRMD7如何參與細(xì)胞分化功能,本研究構(gòu)建了FRMD7野生型、突變體p.A194T、p.H333fs(本實(shí)驗(yàn)室之前所發(fā)現(xiàn)突變)和p.G24R(文獻(xiàn)中報(bào)道的突變)分別與EGFP形成融合蛋白載體,觀察各類突變體和野生型在真核細(xì)胞中定位情況,發(fā)現(xiàn)突變體 p.A194T和野生型類似,主要定位于細(xì)胞質(zhì),而突變體p.G24R和p.H333fs發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,絕大部分融合蛋白集中在細(xì)胞核中。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NLS位

8、于FRMD7氨基酸序列的234位 KRKH,NES位于93位的LTRYLFTLQI。并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。為了進(jìn)一步分析FRMD7蛋白入核后的功能,本實(shí)驗(yàn)分析了其與p53蛋白的共定位分析,結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的共定位情況;另外通過(guò)免疫熒光技術(shù)證明FRMD7在核內(nèi)過(guò)表達(dá)形成的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)也不是細(xì)胞核常見(jiàn)結(jié)構(gòu)Cajal body。說(shuō)明FRMD7對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞分化的促進(jìn)作用可能不是通過(guò)與p53蛋白及Cajal body實(shí)現(xiàn)的。
　　總之,本研究主要

9、是以粘脂累積病及先天性眼球震顫家系為對(duì)象,通過(guò)分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等手段,分析一個(gè)粘脂累積病家系和兩個(gè)先天性眼球震顫的致病原因,同時(shí)對(duì)一個(gè)眼球震顫基因FRMD7蛋白亞細(xì)胞定位的可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討。在粘脂累積病家系發(fā)現(xiàn)的致病基因GNPTG的雜合突變是首次在中國(guó)人群中檢測(cè)到的基因變異,擴(kuò)充了該基因的突變譜;這一研究結(jié)果可以將該疾病與其癥狀相近(粘多糖累積?、颉⒄持鄯e?、驛)的其他疾病準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)來(lái),有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)該家系病人的個(gè)體化治療方

10、案的制定。對(duì)于X連鎖的先天性眼球震顫家系1的研究結(jié)果再一次支持了在中國(guó)人群中,GPR143基因的突變所導(dǎo)致的先天性眼球震顫疾病與在白種人群中表現(xiàn)的I型白化病不同。對(duì)于X連鎖的先天性眼球震顫家系2的研究結(jié)果擴(kuò)展了眼球震顫致病基因FRMD7的突變譜。這些遺傳學(xué)研究結(jié)果對(duì)于疾病的準(zhǔn)確分型至關(guān)重要,是實(shí)施個(gè)體化針對(duì)性治療的基礎(chǔ),而且可以作為遺傳病家系產(chǎn)前診斷的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。對(duì)于FRMD7蛋白功能的初步分析結(jié)果則提示了部分FRMD7的突變所導(dǎo)致的亞