PET分子影像監(jiān)測誘導多功能干細胞治療缺血性腦梗死的實驗研究.pdf

1、腦卒中是國際上致死致殘的第二大疾病，由于損傷或者死亡的神經(jīng)細胞很難再生，同時目前介入治療、手術(shù)等以恢復神經(jīng)功能的治療方法效果有限，因此，腦缺血損傷的治療仍存在瓶頸。
　　最近，應用成體干細胞如神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的細胞療法在增強組織修復和功能恢復方面給人們帶來了很大的希望。NSCs可以分化成各種類型的神經(jīng)細胞，因此對腦缺血損傷擁有巨大的治療潛力。但是，免疫排斥風險及倫理問題卻又極大的限制了其臨

2、床應用。因此，找到一種能代替NSCs的自體來源的全能干細胞變得尤為迫切。
　　近十年來，誘導多功能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的出現(xiàn)避免了免疫排斥問題及倫理問題。研究者通過激活特定的轉(zhuǎn)錄因子而實現(xiàn)體細胞的再編程，進而得到iPSCs。iPSCs在體外被證實能夠分化為前體神經(jīng)干細胞以及神經(jīng)細胞，包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。另外，傳統(tǒng)中藥也是一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄓ绕涫悄X卒中）非常有

3、效的方法。作為其中的代表，清開靈能夠清熱化痰、醒腦開竅、活血化瘀、解毒止痛，具有治療急性出血性和缺血性腦血管病的雙重療效，可降低局灶性缺血腦梗死面積，改善神經(jīng)功能損傷，同時使內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)水平升高而保護腦缺血損傷。
　　然而，為了更好的研究iPSCs在體內(nèi)的生理過程及療效，運用無創(chuàng)、敏感、適用于臨床的細胞示蹤方法及療效評估方法是必需的。因為正電子發(fā)

4、射斷層（positron emission tomography, PET）在臨床上可用于病人的在體細胞追蹤及療效監(jiān)測，所以這一影像模式是評估干細胞療效最合適的方法之一。其中，18F-FDG PET顯像目前是一種研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機理及進程的有力工具。
　　一方面，盡管iPSCs、NSCs以及中藥清開靈已經(jīng)被證實可以促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能恢復，但是還沒有直接將兩種干細胞及干細胞聯(lián)合中藥清開靈應用在腦缺血動物模型中的報道。因

5、此，在本研究中直接比較iPSCs及NSCs的治療作用，并研究干細胞聯(lián)合中藥是否會有更好的效果。另一方面，單一的分子影像技術(shù)并不能提供全面的生理信息，難以實現(xiàn)對于細胞移植后的緊密示蹤。通過兩種或者多種成像技術(shù)的融合，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，能夠更全面地進行干細胞示蹤和獲取生理信息等。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 時空動態(tài)的PET影像活體監(jiān)測誘導多功能干細胞、神經(jīng)干細胞及中藥清開靈治療腦缺血損傷大鼠模型的研究

6、>　　應用大鼠腦缺血損傷模型，用18F-FDG microPET活體、動態(tài)評價iPSCs、NSCs以及中藥清開靈對大鼠腦缺血損傷的治療效果。制作大鼠腦缺血模型，次日，開始每日給予清開靈注射液注射治療，腦缺血再灌注3天后，將培養(yǎng)的帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記的iPSCs和NSCs進行側(cè)腦室定位移植，對照組注射同體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PB

7、S）。于腦缺血損傷后次日及干細胞移植后1周、2周、3周和4周進行microPET掃描，同時進行神經(jīng)行為學評價。作為“核醫(yī)學金標準”，于第4周做完神經(jīng)行為學評價和18F-FDG microPET掃描后，各組立即取1只大鼠用于放射自顯影檢測，以確認microPET掃描結(jié)果。剩余大鼠經(jīng)生理鹽水及預冷的4％多聚甲醛(PH7.4)灌注固定。然后取大腦做免疫組織化學和免疫熒光染色，以了解移植干細胞在腦內(nèi)的存活及分化情況。結(jié)果顯示:與PBS對照組相比

8、，4周時間內(nèi)兩個干細胞治療組、清開靈治療組及兩個聯(lián)合治療組大鼠梗死側(cè)18F-FDG攝取都顯著升高。其中，iPSCs聯(lián)合清開靈治療組在4周時間內(nèi)葡萄糖代謝恢復一直穩(wěn)步增加，并在第3周和第4周顯著高于iPSCs組（P＜0.01）。第1周NSCs聯(lián)合清開靈治療組的18F-FDG攝取最顯著，隨后逐漸下降，而第4周iPSCs聯(lián)合清開靈治療組最顯著。從第3周開始，五個治療組的神經(jīng)功能學評分顯著高于PBS對照組。另外，18F-FDG PET成像結(jié)果與

9、神經(jīng)功能恢復(P＜0.01)以及葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(glucose transporter-1，GLUT-1)陽性細胞數(shù)(P＜0.01)之間具有顯著相關(guān)性。免疫組織化學結(jié)果提示iPSCs聯(lián)合清開靈組的GFAP表達顯著高于iPSCs組。免疫熒光結(jié)果提示移植的iPSCs存活并遷移至梗死區(qū)域，并且表達神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞標志物，移植的NSCs存活并遷移至梗死區(qū)域，并且表達神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞標志物。時空動態(tài)的8F-FDG PET成像等結(jié)果顯

10、示，iPSCs、NSCs分別聯(lián)合清開靈（尤其是iPSCs聯(lián)合清開靈）能夠更加促進腦缺血再灌注損傷后的代謝和功能恢復。與iPSCs單獨治療相比，iPSCs聯(lián)合中藥清開靈是一種更好的治療方法。
　　第二部分 雙模式分子影像活體監(jiān)測iPSCs移植治療缺血性腦損傷的實驗研究
　　iPSCs是一種萬能干細胞，類似胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs），有發(fā)育成任何組織或器官的潛力，有可能成為安全、有效、可控地

11、解決人類面臨的一些醫(yī)學難題的重要方法?；铙w、無創(chuàng)、長期、反復、實時動態(tài)監(jiān)測iPSCs治療的可視化技術(shù)將成為深化研究iPSCs的關(guān)鍵技術(shù)。本研究利用轉(zhuǎn)染sr39tk-Ⅰ-fluc（突變胸苷激酶與熒光素酶）雙報告基因的iPSCs，實施大鼠腦缺血模型的干細胞移植治療;通過microPET和光學分子成像，活體狀態(tài)下直接觀察sr39tk-Ⅰ-fluc雙基因的表達狀況，實現(xiàn)對移植iPSCs實時監(jiān)測;本研究同時致力于評價移植iPSCs在體內(nèi)的分布、存