TC1(C8orf4)在肺癌中的表達和意義研究.pdf

1、目的：
　　TC1(thyroid cancer-1)是近年發(fā)現(xiàn)的由C8orf4基因編碼的核蛋白，它首先被發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌中表達，研究證實，TC1蛋白之所以可以影響細胞的生物學行為，是因為在它的COOH端，有三個緊密螺旋的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可以保證其與相應(yīng)的目的蛋白結(jié)合，進而調(diào)控相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路。另有研究證實，TC1作為Wnt/β-catenin信號通路上游調(diào)節(jié)基因與β-catenin競爭結(jié)合cby(Chibby)，減輕cby對

2、下游靶基因-如cyclin D1，MMP-7，MMP-14，CD44，c-Met等的抑制作用，從而間接的增強Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用，增強腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　但是，肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等三大惡性生物學行為和TC1在肺癌細胞中的表達情況的關(guān)系目前還不明確。為了探究上述問題，本文對肺癌中的TC1表達情況做了檢測，研究并分析TC1表達和臨床病理的關(guān)系，并進一步探討了TC1的甲基化水平，TC1與β-cat

3、enin表達的相關(guān)性。
　　方法：
　　一、組織標本來源
　　在中國醫(yī)科大學倫理委員會的批準下進行。91例肺癌組織來自2008-2010年在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)的病人，組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋?；颊咝g(shù)前均未接受放化療，按國際抗癌聯(lián)盟的肺癌TNM分期標準。根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類標準判定其組織學診斷和分化程度。術(shù)后隨訪上述91例患者。
　　二、細胞系來源
　　人肺癌細胞系H1299、A549

4、、LK2、LTE均源于ATCC(American Type Culture Collection)，細胞均培養(yǎng)于含10％胎牛血清、青霉素(0.1 mg/ml)、鏈霉素(0.1mg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃含5％ CO2的培養(yǎng)箱，按時換液及傳代。
　　三、免疫組織化學染色
　　組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。將石蠟包埋的肺癌組織塊切成4μm厚切片。以PBS代替—抗作為空白對照。使用即用SP超敏免疫組

5、化試劑盒（邁新，福州，中國），兔抗人TC1(1∶200)。兩位病理醫(yī)生對切片分別作出判定，每張組織切片隨機觀察5個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個癌細胞，陽性率根據(jù)陽性癌細胞所占百分比計算。TC1表達主要位于細胞質(zhì)，也可在細胞核中表達。每個病例的TC1的陽性率1％-25％為1分、＞25％-50％為2分、＞50％-75％為3分、＞75％-100％為4分，染色強度分為0分（無著色）、1分（黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）。陽

6、性率與強度評分相乘:≤6分為低表達，≥8分為高表達。當＞10％的癌細胞胞核染色陽性時則該病例定義為核表達陽性。
　　四、DNA提取與亞硫酸鹽處理后測序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)
　　按照北京白太克公司的組織/細胞DNA提取試劑盒說明書提取DNA。準確定量后，按照EZ DNA甲基化試劑盒(ZYMO)說明書進行DNA樣品甲基化修飾處理，獲得DNA產(chǎn)物進行PCR及測序。
　　五、RT-PCR

7、檢測
　　利用總RNA提取試劑盒，嚴格按照說明書提取基因組RNA，建立PCR反應(yīng)體系。將產(chǎn)物純化后，采用ABI3730XL測序儀進行測序。
　　六、Western blot檢測
　　依次經(jīng)過樣本總蛋白的提取定量、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、底物發(fā)光實驗后，最后用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。
　　七、統(tǒng)計分析
　　各組資料利用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

8、P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、肺癌組織中TC1表達與肺癌臨床病理因素的關(guān)系。
　　在肺癌組織中，TC1表達與肺癌的TNM分期(P=0.005)、分化程度(P＜0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.023)顯著相關(guān)。
　　2、肺癌組織中TC1表達水平與肺癌生存概率的關(guān)系。
　　TC1低表達組肺癌患者生存率值明顯高于TC1高表達組(P＜0.05)。
　　3、肺癌細胞中存在TC1基因啟動子甲基

9、化狀態(tài)。
　　在肺癌細胞中，44、81、94、105bp位點均為甲基化狀態(tài)。
　　4、肺癌細胞中TC1與β-catenin的表達相關(guān)性。
　　TC1與β-catenin表達具有協(xié)同現(xiàn)象，rs，分別為0.790、0.589，P值(sig)均＜0.05，二者的表達在肺癌組織中高度正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、TC1的表達與腫瘤的分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　2、TC1高表達與肺癌患者的