肺癌A549細(xì)胞抗脫落凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜研究及TC-1的表達(dá)和意義.pdf

1、背景：
　　肺癌——呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，當(dāng)今世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率，高轉(zhuǎn)移率、高死亡率的特征。大多數(shù)患者首次就診時(shí)即被確診為晚期肺癌，伴有淋巴轉(zhuǎn)移或血行轉(zhuǎn)移。肺癌細(xì)胞一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移就表明其具備了抗脫落凋亡能力，即脫離與基質(zhì)的聯(lián)系能夠免于凋亡繼續(xù)存活，最終在遠(yuǎn)處適宜組織中繼續(xù)增殖，形成轉(zhuǎn)移?？梢?jiàn)，抗脫落凋亡是肺癌轉(zhuǎn)移的始動(dòng)環(huán)節(jié)。
　　脫落凋亡/抗脫落凋亡過(guò)程是一個(gè)非常精密的調(diào)控過(guò)程，基因網(wǎng)絡(luò)及其信號(hào)通路嚴(yán)密調(diào)控這一

2、過(guò)程，任何一個(gè)基因表達(dá)的變化及其信號(hào)通路的改變都會(huì)影響細(xì)胞脫落凋亡/抗脫落凋亡的能力，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。許多腫瘤轉(zhuǎn)移的本質(zhì)就是由某個(gè)介導(dǎo)脫落凋亡/抗脫落凋亡的基因發(fā)生改變而引發(fā)的。目前對(duì)于脫落凋亡/抗脫落凋亡的研究?jī)H限于單個(gè)基因或某一通路的改變，沒(méi)有全面的對(duì)全基因組進(jìn)行分析，從而缺乏系統(tǒng)的、有針對(duì)性的研究，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)肺癌A549細(xì)胞全基因組進(jìn)行分析，比較脫落凋亡/抗脫落凋亡兩種狀態(tài)下的基因表達(dá)差異，并從中挑選出表達(dá)差異最大的基因

3、進(jìn)一步研究，既全面分析又針對(duì)性研究，進(jìn)一步揭示肺癌細(xì)胞脫落凋亡/抗脫落凋亡的分子基礎(chǔ)。
　　甲狀腺癌相關(guān)基因1（ThyroidCancergene-1TC-1），又名c8orf4基因，定位于8P11.2，廣泛表達(dá)于脊柱動(dòng)物，高度表達(dá)于多種惡性腫瘤組織中；編碼一種含106個(gè)氨基酸的固有無(wú)序蛋白，該蛋白COOH端三個(gè)區(qū)域(D44-R53,K58-A64,andD73-T88)易形成緊密的螺旋結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其與目的蛋白的結(jié)合能力，參與調(diào)控W

4、nt/β-Catenin通路和FGFR2通路，促進(jìn)細(xì)胞癌變和抗脫落凋亡；也參與調(diào)控NF-KB通路，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和熱休克反應(yīng)。但是目前對(duì)于TC-1基因與肺癌的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合基因芯片分析結(jié)果，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及WesternBlot技術(shù)檢測(cè)TC-1基因及編碼蛋白在肺癌A549細(xì)胞及抗脫落凋亡肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步研究其與肺癌A549細(xì)胞抗脫落凋亡的關(guān)系，為以后研究TC-1與肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　

5、　目的：
　　篩選出肺癌A549細(xì)胞抗脫落凋亡相關(guān)基因，并探討TC-1基因的表達(dá)和意義。
　　方法：
　　應(yīng)用懸浮培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞建立抗脫落凋亡模型；運(yùn)用DNA電泳檢驗(yàn)抗脫落凋亡模型；使用貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞的總RNA制備人類V2.0全基因組寡核苷酸微陣列芯片（35khumanGenomeArray）；通過(guò)基因芯片發(fā)現(xiàn)肺癌A549細(xì)胞貼壁培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的差異基因；利用NCBIPubmed數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與

6、腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡相關(guān)的基因，并從中找出表達(dá)差異倍數(shù)最大的基因；運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)及蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）技術(shù)測(cè)定表達(dá)差異倍數(shù)最大基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立肺癌A549細(xì)胞抗脫落凋亡模型。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，相互聚集呈團(tuán)塊狀，且細(xì)胞團(tuán)塊隨著時(shí)間的延長(zhǎng)越大、越緊密；提取其DNA行瓊脂糖凝膠電泳分析證實(shí)其免于脫落凋亡，具備抗脫落凋亡的能力；
　　2、成功制備肺癌A

7、549細(xì)胞貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下的全基因組芯片——人類V2.0全基因組寡核苷酸微陣列芯片（35KHumanGenomeArray），并發(fā)現(xiàn)肺癌貼壁狀態(tài)和懸浮狀態(tài)（抗脫落凋亡狀態(tài)）存在差異基因745個(gè)，這些基因涉及多方面的功能基因和結(jié)構(gòu)基因，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)63個(gè)與腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡密切相關(guān)的基因，并篩選出表達(dá)差異倍數(shù)最大的基因——TC-1基因；
　　3、在基因水平驗(yàn)證TC-1基因在肺癌細(xì)胞中表達(dá)，且懸浮培養(yǎng)狀態(tài)較貼壁培養(yǎng)狀態(tài)高表達(dá)