來氟米特對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、來氟米特(Leflunomide，LEF)為合成序號(hào)為HWA2486的異惡唑類藥物，又名N-（4-三氟-甲苯）-5-甲基異噁唑-4-咪唑羧酰胺，分子結(jié)構(gòu)為C12H9F3N2O2，分子量270.2。是一種以治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)為主的抗增殖活性免疫抑制劑。
　　丙二酸次氮酰胺(A771726)是LEF在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效的代謝產(chǎn)物。A771726可逆地抑制二氫乳氫酸脫氫酶(DHODH)的活性，DHODH失活將影響活化淋巴細(xì)胞的嘧啶合成

2、過程。除此之外，A771726還會(huì)抑制NF-κB的激活，影響?zhàn)じ椒肿拥谋磉_(dá)，例如細(xì)胞間粘附因子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1)等。與某些抗腫瘤藥物機(jī)制類似。我們推測(cè)LEF對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖和凋亡可能具有一定的影響作用。
　　目的:
　　探究腎癌細(xì)胞用LEF處理后，其增殖和凋亡的變化情況。并深入分析LEF對(duì)腎癌細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　方法:
　　腎癌細(xì)胞株786-O

3、和Caki-2作為實(shí)驗(yàn)材料，用不同濃度的LEF(50、100、200μM)處理不同的時(shí)間(24、48、72 h)，加0.1％的DMSO的組作為對(duì)照。
　　1.LEF對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響的檢測(cè)采用MTS實(shí)驗(yàn)，EdU摻入實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。LEF對(duì)腎癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)周期蛋白的影響檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。
　　2.LEF對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的影響檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，LEF對(duì)腎癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白

4、的表達(dá)的影響的檢測(cè)采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，LEF對(duì)腎癌細(xì)胞自噬的影響的檢測(cè)采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　3.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析LEF處理Caki-2細(xì)胞后，β-catenin，c-Myc，Wnt3a，Wnt1等的表達(dá)，采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)使用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路制劑或改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的量后腎癌細(xì)胞對(duì)LEF敏感性的變化，采用基因芯片技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)和驗(yàn)證LEF對(duì)腎癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)

5、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.LEF對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響
　　MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的LEF作用于Caki-2細(xì)胞和786-O細(xì)胞48h后，細(xì)胞活力都劑量依賴性降低，但Caki-2細(xì)胞對(duì)LEF的作用更為敏感。LEF濃度≥100μM時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低，并且具有時(shí)間依賴性。Caki-2細(xì)胞用不同濃度的LEF處理48h后，用EdU摻入法檢測(cè)DNA的合成，以檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，結(jié)果顯示，陽性細(xì)胞的數(shù)

6、量以劑量依賴的方式顯著減少。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，在藥物處理過程中，LEF濃度超過50μM時(shí)幾乎完全抑制細(xì)胞克隆的形成。LEF處理后，細(xì)胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白CyclinA，CyclinD1和CDK2表達(dá)下降，而作為CDK的抑制因子，p21蛋白表達(dá)增加，Caki-2細(xì)胞發(fā)生S期細(xì)胞周期阻滯。
　　2.LEF引發(fā)腎癌細(xì)胞凋亡和自噬
　　LEF能夠介導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，在200μM的濃度下，凋亡最顯著，此時(shí)PARP-1和Casp

7、ase-3出現(xiàn)了剪切片段。Bcl-2和APE/REF-1這些抗凋亡蛋白的表達(dá)降低，而另一抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá)在藥物處理后幾乎不受影響，同時(shí)Bax作為促凋亡蛋白表達(dá)增加。此外，轉(zhuǎn)染LC3-GFP質(zhì)粒的Caki-2細(xì)胞經(jīng)LEF處理后，原本彌漫的LC3-GFP在細(xì)胞質(zhì)中成簇積累，呈現(xiàn)斑塊狀。表明細(xì)胞發(fā)生了自噬。在50μM的LEF組雖然不能觀察到明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，卻能觀察到明顯的自噬現(xiàn)象。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)到P62蛋白隨LEF濃度增加

8、而減少以及表達(dá)升高的自噬蛋白LC3-Ⅱ。
　　3.LEF對(duì)腎癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究結(jié)果
　　(1)高濃度LEF影響Caki-2細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平。這種影響主要表現(xiàn)為改變?chǔ)?catenin蛋白的量，而不是其在mRNA水平上的表達(dá)。β-catenin基因下游的一個(gè)癌基因c-Myc，不但在蛋白水平上表達(dá)減少，在mRNA水平上表達(dá)也顯著下調(diào)。除此之外，LEF處理Caki-2細(xì)胞一定的時(shí)間后，可以看到細(xì)胞內(nèi)的β-cate

9、nin蛋白出核，并且在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)濃聚點(diǎn)狀分布。以上這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分表明了LEF可以在腎癌細(xì)胞內(nèi)抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。
　　(2)LEF與蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)共同處理加強(qiáng)了Caki-2細(xì)胞內(nèi)肛catenin蛋白的降解程度，泛素化抑制劑MG-132與LEF共處理Caki-2細(xì)胞，能夠反轉(zhuǎn)LEF對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的抑制作用，但自噬抑制劑HCQ卻不能。說明在LEF處理后蛋白降解作

10、用使Caki-2細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白數(shù)量降低。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明，100 iμM和200μM的LEF處理有效地抑制了Caki-2細(xì)胞內(nèi)AKT激酶的磷酸化。因此，LEF誘導(dǎo)β-catenin蛋白的降解可歸因于AKT激酶的磷酸化被抑制。
　　(3)LEF處理后Caki-2細(xì)胞內(nèi)Wnt3a表達(dá)升高。Wnt1表達(dá)略有下降，Wnt5a表達(dá)基本不發(fā)生變化。Wnt信號(hào)的分泌抑制劑IWP-2與LEF聯(lián)合處理Caki-2細(xì)胞能夠增強(qiáng)LEF對(duì)細(xì)

11、胞的毒性作用，即LEF和IWP-2共同處理極大地提高了Caki-2細(xì)胞的凋亡水平。LEF單獨(dú)處理時(shí)，Caki-2細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白β-catenin，c-Myc和CyclinD1的表達(dá)下降程度沒有聯(lián)合加藥時(shí)大。所以，細(xì)胞可能在LEF處理后上調(diào)Wnt3a的表達(dá)來減少藥物的毒性作用，即過表達(dá)Wnt3a來抗衡細(xì)胞的抑增殖和促凋亡作用。
　　(4)基因芯片結(jié)果顯示，100μM的LEF處理48 h以后，Caki-2細(xì)胞內(nèi)Wnt受體FZD10的表

12、達(dá)降低超過800倍，F(xiàn)zd1和Fzd2的mRNA水平也有所降低。
　　結(jié)論:
　　LEF處理后，腎癌細(xì)胞生長變緩慢，同時(shí)發(fā)生了自噬和細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出了LEF對(duì)腎癌細(xì)胞的毒性作用。LEF之所以能夠抑制腎癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，可能是因?yàn)槟I癌細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被抑制了。高濃度LEF處理組細(xì)胞內(nèi)β-caenin蛋白從細(xì)胞核出來，點(diǎn)狀聚集在細(xì)胞質(zhì)中，LEF抑制AKT激酶的磷酸化而使β-caten

13、in蛋白水解，抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，LEF通過影響β-catenin的穩(wěn)定性及其定位的變化，使細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、c-Myc、Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體蛋白FZD10，F(xiàn)ZD2表達(dá)下降。但同時(shí)，高濃度的LEF又上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體Wnt3a在mRNA上的表達(dá)水平以抵抗LEF的抗增殖和促凋亡效應(yīng)。高濃度的LEF可以通過抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化