ABCG2表達(dá)變化對(duì)結(jié)直腸癌模型癌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平的影響.pdf

1、背景與目的：
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)常見惡性腫瘤中其死亡率位列第五。2015年國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)政醫(yī)管局、中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)制訂的《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范》指出，我國(guó)2011年結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別為23.03/10萬(wàn)和11.11/10萬(wàn)。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過程。流行病學(xué)和腫瘤分子生物學(xué)表明氧化應(yīng)激(oxidative stress

2、，OS)、炎癥與結(jié)直腸癌之間密切相關(guān)。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)產(chǎn)生或釋放的氧自由基、炎性細(xì)胞因子和趨化因子可誘導(dǎo)DNA損傷、細(xì)胞增生和血管生成而促發(fā)腫瘤。細(xì)胞膜三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員G2(ATP-binding cassette family G2，ABCG2)是一種由655個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白，其編碼基因位于人類染色4q22，屬ABC基因家族。目前關(guān)于結(jié)直腸癌中ABCG2的研究主要涉及其作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子與化療耐藥機(jī)制的關(guān)系，

3、至于其它方面作用了解甚少。本課題組前期體外研究首次發(fā)現(xiàn)ABCG2具有保護(hù)結(jié)直腸細(xì)胞免受活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷作用，該效應(yīng)可能與ABCG2抑制細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路及抑制相關(guān)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察了人結(jié)直腸癌裸鼠模型中ABCG2表達(dá)變化對(duì)體內(nèi)組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平的影響，為結(jié)直腸癌靶向治

4、療提供新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、常規(guī)培養(yǎng)LoVo、HCT-116、HT-29三種人結(jié)腸癌細(xì)胞株。采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)不同細(xì)胞株中ABCG2蛋白表達(dá)情況。從中選擇較高表達(dá)ABCG2的人結(jié)腸癌細(xì)胞作為后續(xù)研究對(duì)象。
　　2、采用shRNA慢病毒干擾系統(tǒng)抑制所選細(xì)胞株癌細(xì)胞內(nèi)ABCCG2的表達(dá)（shABCG2組細(xì)胞），同時(shí)設(shè)立僅轉(zhuǎn)染病毒載體的陰性對(duì)照組（shcont組細(xì)胞）。利用熒光顯

5、微鏡觀察病毒感染效率，采用Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中ABCG2蛋白水平，驗(yàn)證ABCG2沉默效果。選擇合適的病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）及感染時(shí)間進(jìn)行后續(xù)研究。
　　3、采用不同濃度（0、0.5、1.0 mM;）H2O2處理兩組細(xì)胞4h，用超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒和總谷胱甘肽(total glutathione)檢測(cè)試劑盒，分

6、別測(cè)定兩組細(xì)胞內(nèi)SOD、總谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)及谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase，GR)活力;同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡狀況。
　　4、將shABCG2組細(xì)胞或shcont組細(xì)胞分別注入裸鼠皮下，建立人結(jié)直腸癌小鼠模型（分別為shABCG2組小鼠與shcont組小鼠）。
　　5、采用免疫熒光檢測(cè)法測(cè)定兩組小鼠移植瘤新鮮組織標(biāo)本中ROS水平變化。
　　6、采用總谷胱甘肽檢測(cè)試劑

7、盒測(cè)定兩組小鼠移植瘤新鮮組織標(biāo)本中總谷胱甘肽及GR水平。
　　7、采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)兩組小鼠移植瘤新鮮組織中白介素8(interleukin-8，IL-8)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、血清中白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平;采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real tim

8、e RT-PCR)檢測(cè)兩組小鼠移植瘤新鮮癌組織標(biāo)本中IL-8、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因β(growth regulated oncogene-β,GRO-β) mRNA水平。
　　8、采用Western blot及免疫組化法檢測(cè)兩組小鼠移植瘤新鮮組織中IκB-α和磷酸化IκB-α(phospho-IκB，p-IκB-α)表達(dá)狀況。
　　結(jié)果：
　　1、三株人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABCG2蛋白存在不同程度的表達(dá)，以HT-29細(xì)胞株AB

9、CG2表達(dá)相對(duì)較高，故選擇HT-29進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、熒光顯微鏡檢測(cè)可見細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒效率達(dá)90％以上，Western blot結(jié)果顯示shABCG2組細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)水平明顯低于shcont組細(xì)胞，表明ABCG2-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染能有效地抑制shABCG2組細(xì)胞內(nèi)ABCG2表達(dá)，同時(shí)確定MOI值為20，轉(zhuǎn)染時(shí)間為24h。
　　3、與H2O2(0mM)未處理比較，0.5 mM或1.0mMH2O2處理兩組細(xì)胞4

10、h后，細(xì)胞內(nèi)SOD與總谷胱甘肽水平均降低;而與shcont組細(xì)胞比較，0.5 mM或1.0 mM H2O2處理shABCG2組細(xì)胞后SOD與總谷胱甘肽含量降低更明顯。同時(shí)，隨著H2O2處理濃度增加，兩組細(xì)胞凋亡數(shù)也增多，但shABCG2組細(xì)胞凋亡程度均低于shcont組細(xì)胞。
　　4、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中ROS含量明顯增加。
　　5、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組

11、織中總谷胱甘肽含量和GR活力下降。
　　6、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中IL-8、TNF-α水平明顯增高，血清中IL-6含量明顯增高。
　　7、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中IL-8 mRNA水平未見變化，GRO-βmRNA水平明顯增高。
　　8、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中IκB-α表達(dá)下降，p-IκB蛋白表達(dá)上升。
　　結(jié)