海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染沉默AP4M1基因的慢病毒后AMPA受體的表達變化.pdf

1、目的
　　原代培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元，并轉(zhuǎn)染包裝了沉默銜接蛋白復合物-4μ亞基（adaptor-related protein complex4, mu1 subunit；AP4M1）基因的慢病毒后，觀察細胞 AP4M1、GluR1及 GluR2（AMPA受體）的表達變化，以探究 AP4M1可能介導的AMPA受體運輸變化的分子機制。
　　材料及方法
　　本課題將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)作為實驗對象，應用免疫熒光來標記神經(jīng)元特異性烯

2、醇化酶（neuron-specifice nolase,NSE），來鑒定所培養(yǎng)細胞中神經(jīng)元的純度。細胞培養(yǎng)中進行慢病毒（沉默 AP4M1基因）轉(zhuǎn)染，并進行熒光檢測，以鑒定轉(zhuǎn)染效率，實驗分組：陰性慢病毒轉(zhuǎn)染組及陽性慢病毒轉(zhuǎn)染組（AP4M1基因表達沉默）。
　　分別應用 Real-time PCR和 Western blotting方法研究 AP4M1、GluR1及GluR2的mRNA及蛋白水平的表達變化。
　　結(jié)果
　　

3、1、海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染
　　原代培養(yǎng)的 SD大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)細胞生長良好，在種植后第7天神經(jīng)元基本發(fā)育成熟，神經(jīng)元免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示所培養(yǎng)細胞中的神經(jīng)元純度大于95％。在培養(yǎng)第2天可行慢病毒的轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染8-12小時后換液，并于72小時后重復轉(zhuǎn)染1次，再轉(zhuǎn)染8-12h，72小時后進行熒光檢測，轉(zhuǎn)染率大于85%。
　　2、海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染慢病毒后AP4M1、GluR1及GluR2的表達變化
　　1）Rea

4、l-time PCR檢測：陽性病毒組 AP4M1 mRNA表達量較陰性病毒組顯著下調(diào)（t=68.193，P<0.01，n=8）；轉(zhuǎn)染后 GluR1、GluR2 mRNA表達量較陰性病毒組也明顯下降（t=8.060，P<0.01，n=8）；（t=8.154，P<0.01，n=8）。
　　2）Western blot檢測：轉(zhuǎn)染陽性病毒后AP4M1、GluR1及GluR2蛋白表達量較陰性病毒組顯著下調(diào)（F=7.566，t′=15.966