HIF-2α對人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞特性的影響及相關(guān)MAPK-ERK通路的研究.pdf

1、目的：
　　1.人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)是移植治療的種子細(xì)胞，但體外環(huán)境的改變影響干細(xì)胞的多種特性而限制了其應(yīng)用。為尋找更合適的培養(yǎng)條件以進(jìn)一步促進(jìn)hPMSCs的優(yōu)勢特性，本實(shí)驗(yàn)?zāi)MhPMSCs在體內(nèi)的低氧微環(huán)境，探究生理性低氧培養(yǎng)對hPMSCs的影響。
　　2.更重要的，為提供相關(guān)的理論支持，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究低氧誘導(dǎo)因子-2

2、α(hypoxia-inducible factor-2 alpha，HIF-2α)對hPMSCs優(yōu)勢特性的調(diào)節(jié)作用，旨在揭示其中的分子機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)過程，為更好地保持hPMSCs的優(yōu)勢特性以提高其細(xì)胞移植的應(yīng)用價(jià)值而奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.對比常氧(21％ O2)、低氧(5％O2)不同培養(yǎng)環(huán)境對hPMSCs的原始形態(tài)、細(xì)胞擴(kuò)增(EdU流式細(xì)胞術(shù)檢測)及EPAS1(HIF-2α)表達(dá)(qRT-PCR檢測)的影響。

3、r>　　2.通過慢病毒過表達(dá)或shRNA沉默的方法，增強(qiáng)或減弱HIF-2α的作用，以研究其對hPMSCs的影響。因此將重組慢病毒:過表達(dá)HIF-2α的及其陰性對照-空載體，沉默HIF-2α的shRNA及其陰性對照shRNA，分別感染hPMSCs構(gòu)建四種細(xì)胞。用共聚焦顯微鏡觀察其形態(tài)并用流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面標(biāo)志。
　　3.在基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞水平上，應(yīng)用qRT-PCR，WB和IF的方法，驗(yàn)證構(gòu)建的四種hPMSCs中HIF-2α的表達(dá)

4、情況。同樣應(yīng)用EdU流式細(xì)胞術(shù)檢測這四種細(xì)胞的擴(kuò)增率。分析HIF-2α的表達(dá)水平對hPMSCs擴(kuò)增的影響。
　　4.研究HIF-2α對下游分子的調(diào)控以解釋其對hPMSCs優(yōu)勢特性的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。提取四種hPMSCs中的RNA，在分別對應(yīng)的兩組中通過qRT-PCR檢測相關(guān)基因的相對表達(dá)量。應(yīng)用WB和IF驗(yàn)證qRT-PCR的主要結(jié)果。
　　5.為驗(yàn)證HIF-2α調(diào)節(jié)作用的信號(hào)傳導(dǎo)過程，應(yīng)用MAPK/ERK通路的特異阻滯劑，即PD

5、0325901，用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測在通路信號(hào)阻斷或空白處理下四種細(xì)胞的擴(kuò)增生長情況，并用qRT-PCR檢測對比下游基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與常氧(21％ O2)培養(yǎng)相比，hPMSCs培養(yǎng)于低氧(5％ O2)環(huán)境中表現(xiàn)出更原始的形態(tài)，有更高的擴(kuò)增能力并伴有EPAS1(HIF-2α)更多的表達(dá)。
　　2.成功構(gòu)建了兩組、共四種不同的細(xì)胞:過表達(dá)HIF-2α的hPMSCs（即 hPMSCs+HIF-2α)及其陰性

6、對照hPMSCs+NC;HIF-2α沉默的hPMSCs(即hPMSCs-HIF-2α)及其陰性對照hPMSCs-NC。與未處理的hPMSCs相比，這四種細(xì)胞在形態(tài)上并無改變，且穩(wěn)定表達(dá)GFP，對于間充質(zhì)干細(xì)胞的典型表面標(biāo)志(陽性:CD73，CD90，CD105;陰性:CD34，CD45)也保留原有的表達(dá)特點(diǎn)。
　　3.四種細(xì)胞中，在基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞水平上，hPMSCs的擴(kuò)增與HIF-2α表達(dá)高低成正相關(guān):過表達(dá)HIF-2α的hP

7、MSCs+HIF-2α相比其陰性對照hPMSCs+NC表達(dá)更多HIF-2α，同時(shí)其擴(kuò)增率也更高。相反，沉默HIF-2α的hPMSCs-HIF-2α與其陰性對照hPMSCs-NC相比，HIF-2α表達(dá)量較低，擴(kuò)增率也更低。
　　4.擴(kuò)增相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子:CCND1(CyclinD1)和MYC(c-Myc)，以及原始干細(xì)胞的主要標(biāo)志:POU5F1(Oct4)，它們的mRNA相對表達(dá)量，在HIF-2α過表達(dá)的hPMSCs+HIF-2α中高于

8、其陰性對照hPMSCs+NC。HIF-2α沉默的hPMSCs-HIF-2α相比對照hPMSCs-NC，其CCND1，MYC和POU5F1的相對表達(dá)量更低。同時(shí)，WB和IF證明了與qRT-PCR相同的結(jié)果。
　　5.MAPK/ERK信號(hào)通路的必要組分:KRAS，RAF1，MAP2K1，MAP2K2，MAPK3和MAPK1在hPMSCs+HIF-2α中的mRNA相對表達(dá)量高于其陰性對照hPMSCs+NC。然而，相比hPMSCs-NC，

9、這些基因在hPMSCs-HIF-2α中表達(dá)均降低（除了RAF1改變不明顯）。在這四種細(xì)胞中，低氧誘導(dǎo)因子的靶基因VEGFA也有上述表達(dá)趨勢，但是HIF-2α的異構(gòu)體:HIF-1α(HIF1A)的表達(dá)沒有差別。同時(shí)，WB和IF證實(shí)了MAPK/ERK通路的效應(yīng)蛋白質(zhì):p-Erk1/2有與其qRT-PCR相同的結(jié)果。
　　6.與空白對照處理組相比，在PD0325901(MAPK/ERK通路)阻滯處理組，hPMSCs+HIF-2α與hPM

10、SCs+NC的擴(kuò)增均降低。相似地，hPMSCs-HIF-2α和hPMSCs-NC也在PD0325901處理后擴(kuò)增明顯受阻。與相應(yīng)的空白處理組相比，PD0325901處理的四種細(xì)胞中擴(kuò)增標(biāo)志CCND1和MYC均表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　1.相比常規(guī)的常氧(21％ O2)環(huán)境，生理性低氧(5％O2)培養(yǎng)更利于人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增生長及原始形態(tài)的保持并促進(jìn)其HIF-2α(EPAS1)的表達(dá)。
　　2.HIF-2α通過調(diào)

11、控CCND1(CyclinD1)和MYC(c-Myc)促進(jìn)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增，同時(shí)通過調(diào)節(jié)POU5F1(Oct4)維持人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的原始干性。所以HIF-2α正向調(diào)控人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增與干性。
　　3.低氧相關(guān)的HIF-2α通過MAPK/ERK通路的Ras-Raf1-Mek1/2-Erk1/2信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)CCND1和MYC基因表達(dá)促進(jìn)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增。這一發(fā)現(xiàn)對于提高人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)勢特性在細(xì)胞移