TSG101對乳腺癌細胞的作用及與HIF-1α、MAPK-ERK信號通路的關系.pdf

1、目的：
　　 腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)是1996年在NIH3T3鼠成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)的。TSG101蛋白介導了多種生物學功能,如調(diào)控囊泡運輸、細胞周期等,在多種類型的人類惡性腫瘤中存在異常表達,但其與腫瘤發(fā)生的關系尚未完全闡明。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra cellular signal-regulated proteinkinase,ERK)是絲裂原活化蛋白

2、激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)家族的經(jīng)典轉導通路之一,在促進細胞的增殖、分化及抑制細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一種低氧條件下誘導產(chǎn)生的轉錄因子,在多效性低氧應答中發(fā)揮關鍵作用。有研究顯示TSG101在轉基因小鼠乳腺中的過表達導致了MAPK/ERK信號通路的異常激活。另有研究表明多種因素均可以通過激活MA

3、PK/ERK信號途徑來介導HIF-1α的產(chǎn)生。而迄今為止,在人類乳腺癌中,這些分子的相關調(diào)控作用如何尚不清楚。因此,本研究采用靶向TSG101的siRNA方法特異性下調(diào)了乳腺癌細胞系中TSG101蛋白的表達,觀察TSG101的下調(diào)對乳腺癌細胞系生物學特性的影響,同時檢測了人乳腺癌組織中三者的表達及相關性,探討了TSG101與HIF-1α、MAPK/ERK信號通路的關系。
　　 實驗材料與方法
　　 1、應用脂質(zhì)體法將靶向

4、TSG101的siRNA轉染入人乳腺癌細胞系MCF-7細胞中。以未轉染的MCF-7細胞及轉染普適型陰性對照siRNA(siRNA NC)的MCF-7細胞作為陰性對照。
　　 MTT比色法:1×103個/孔的細胞數(shù)分別接種轉染組和對照組細胞于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),酶標儀機檢前加入MTT培養(yǎng)細胞4小時,DMSO溶解沉淀顆粒,連續(xù)4天檢測各組細胞的吸光度值,檢測細胞增殖能力。
　　 細胞周期檢測:分別收集TSG101 siRNA

5、轉染后72小時的MCF-7細胞和對照組細胞,70％乙醇4℃固定,將細胞密度調(diào)整至1×106/ml,PI染色后,流式細胞儀檢測細胞周期變化,Modfit LT V3.0軟件分析結果。
　　 細胞凋亡檢測:分別收集TSG101 siRNA轉染后72小時的MCF-7細胞和對照組細胞,以binding buffer重懸細胞,調(diào)整細胞密度為1×106/ml,加入Annexin Ⅴα-FITC和PI染液,流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化。

6、>　　 細胞遷移能力檢測(transwell小室法):分別收集TSG101 siRNA轉染后48小時的MCF-7細胞和對照組細胞,接種到含有微孔濾膜的transwell小室,37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時后,95％乙醇固定,胎盤藍染色,顯微鏡下觀察細胞遷移能力的改變情況。
　　 免疫熒光:分別取TSG101 siRNA轉染后72小時的MCF-7細胞爬片和對照組細胞爬片,4％多聚甲醛固定,Triton X-100處理,BSA封閉

7、后,分別滴加HIF-1α、p-ERK一抗,4℃孵育過夜。避光加FITC標記二抗,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,檢測TSG101下調(diào)前后HIF-1α、p-ERK蛋白的變化。
　　 Western blot:分別提取轉染組和對照組細胞蛋白,采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取等量蛋白,進行SDS-PAGE凝膠電泳和轉印,分別加入TSG101、HIF-1α、ERK1/2、p-ERK一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗孵育后ECL發(fā)光。以β-

8、actin作為內(nèi)對照。檢測TSG101 siRNA后MCF-7細胞中TSG101、HIF-1α、ERK1/2和p-ERK蛋白的表達。
　　 2、本研究采用54例乳腺癌組織標本,均來自中國醫(yī)科大學第一臨床學院2004年-2005年行外科切除手術的乳腺癌患者,所有患者術前均未接受過放療、化療。
　　 標本經(jīng)4％甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片,經(jīng)脫蠟,脫苯,水化后,采用鏈霉菌抗生物素蛋白.過氧化物酶免疫組化法(S-P

9、)法檢測TSG101、HIF-1α和p-ERK蛋白表達,以PBS代替一抗作為陰性對照,以已知陽性乳腺癌切片作為陽性對照。結果判定:以細胞漿和(或)細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機選取5個高倍視野,每個視野計數(shù)200個腫瘤細胞,共計1000個細胞。首先按染色強度評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;再按陽性細胞所占百分比評分:陰性為0分,陽性細胞數(shù)≤10％為1分,11％～60％為2分,51％～75％為3

10、分,>75％為4分；最后按二者乘積分數(shù)≥3定為陽性,<3為陰性。
　　 3、應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果
　　 1、使用Western blot方法,應用抗TSG101單克隆抗體檢測,在45KD處可見特異性染色條帶。以β-actin作內(nèi)參照,對Western blot結果進行灰度測定和分析,發(fā)現(xiàn)TSG101 siRNA組的細胞TSG101蛋白相對

11、表達量(0.1338±0.0086,0.0708±0.0091)與對照組(0.5460±0.0145,0.4782±0.6778)相比明顯降低(P<0.05)。
　　 2、TSG101 siRNA轉染后,細胞增殖能力減弱,細胞凋亡率增加,細胞周期阻滯。MTT法檢測結果表明,TSG101 siRNA組的細胞增殖能力明顯低于對照組細胞(P<0.05)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),TSG101 siRNA組的細胞凋亡率增加,為13.71±1.

12、31％,與對照組相比(4.37±0.87％,6.00±0.08％),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。細胞周期檢測顯示,TSG101 siRNA組細胞G0/G1期比例(70.51±0.23％)與對照組(59.15±0.77％,59.21±0.68％)相比明顯增多(P<0.01)；S期細胞(23.65±0.78％)與對照組(34.96±0.45％,34.89±0.30％)相比明顯減少(P<0.01)。
　　 3、TSG101 si

13、RNA轉染后,細胞遷移能力減弱。transwell小室檢測細胞遷移能力實驗發(fā)現(xiàn),TSG101 siRNA組的細胞遷移數(shù)(4.60±0.80)與對照組(24.47±1.90,23.80±2.20)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 4、TSG101 siRNA轉染后,HIF-1α和p-ERK蛋白表達減少。免疫熒光染色結果可見,TSG101 siRNA轉染后,細胞HIF-1α和p-ERK蛋白染色強度與對照組相比明顯減弱。W

14、estern blot結果顯示,TSG101 siRNA轉染后,HIF-1α蛋白相對表達量(0.1235±0.0057)與對照組(0.6762±0.0080)相比,明顯減少(P<0.01)；TSG101siRNA轉染后,p-ERK蛋白相對表達量(0.1582±0.0093)與對照組(0.5078±0.0036)相比明顯減少(P<0.01)。
　　 5、免疫組化結果顯示,TSG101、HIF-1α和p-ERK蛋白主要定位于乳腺癌細

15、胞漿和(或)細胞核內(nèi),呈棕黃色顆粒,陽性率分別為74.07％(40/54)、77.78％(42/54)、81.48％(44/54)。統(tǒng)計學分析顯示,TSG101和HIF-1α在乳腺癌中的蛋白表達存在正相關(P<0.05)；TSG101和p-ERK在乳腺癌中的蛋白表達存在正相關(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、TSG101的下調(diào)能夠抑制乳腺癌細胞增殖,誘導乳腺癌細胞凋亡,阻滯乳腺癌細胞周期于G1/S期,并降低其遷

16、移能力。
　　 2、TSG101和HIF-1α在乳腺癌組織中的蛋白表達存在正相關,并且TSG101的下調(diào)能夠減少乳腺癌細胞中HIF-1α蛋白的表達,提示TSG101在乳腺癌中可能對HIF-1α的基因表達和轉錄活性具有調(diào)節(jié)作用。
　　 3、TSG101和p-ERK在乳腺癌組織中的蛋白表達存在正相關,并且TSG101的下調(diào)能夠減少乳腺癌細胞中p-ERK蛋白的表達,提示TSG101在乳腺癌中可能通過MAPK/ERK信號通路發(fā)揮