白藜蘆醇通過重塑腸道菌群改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起的心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)已經(jīng)成為威脅人類健康的首要死因。尋找有效抗AS的策略對(duì)于降低CVD的發(fā)病率和死亡率具有十分重要的科學(xué)意義。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是膳食中天然存在的多酚類植物化合物，主要富含于葡萄等漿果類水果、花生及紅酒中，具有多種生物學(xué)活性。大量研究表明，RSV對(duì)AS的發(fā)生發(fā)展具有明顯的防治作用，但機(jī)制尚未明確

2、。同時(shí)許多證據(jù)表明，RSV的血漿濃度低、代謝速率快，其較低的生物利用率與其顯著的生物學(xué)活性之間形成了一個(gè)明顯的“悖論”。體內(nèi)較低水平的RSV如何發(fā)揮顯著的抗AS作用，其抗AS作用是否還存在其它機(jī)制，如何為這一“悖論”提供合理解釋，是亟待解決的重要科學(xué)問題。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群組分改變和功能失調(diào)在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，已成為防治AS的新靶點(diǎn)。腸道菌群由上萬(wàn)億個(gè)共生微生物組成，以人體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分維持生存和代謝，并與人體

3、共同對(duì)外界的環(huán)境因素做出反應(yīng)，進(jìn)行代謝和免疫活動(dòng)維持人體健康。研究證實(shí)，腸道菌群一方面通過代謝膳食卵磷脂產(chǎn)生三甲胺(trimethylamine，TMA)，而后TMA經(jīng)肝臟黃素單加氧酶(flavin monooxygenases，F(xiàn)MO)活化生成一種新的獨(dú)立的AS危險(xiǎn)因子氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)，而誘發(fā)AS發(fā)生;另一方面腸道菌群可通過減少膽汁酸在腸道的水解，從而抑制肝臟膽汁酸的合成，引起膽固醇

4、的代謝紊亂進(jìn)而促進(jìn)AS的進(jìn)程。此外，越來越多的證據(jù)表明包括RSV在內(nèi)的多種植物化學(xué)物能夠通過影響和重塑腸道菌群進(jìn)而發(fā)揮健康功效。因此，基于國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，我們提出如下假說:RSV可能通過影響腸道菌群從而分別減少TMAO生成和調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，進(jìn)而降低AS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。為了驗(yàn)證該假說，本課題以腸道菌群為靶點(diǎn)，從腸道菌群依賴的TMAO生成途徑及膽汁酸代謝途徑兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，以C57BL/6J和ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象，利用腸道菌群研究的主要

5、技術(shù)方法（16SrRNA高通量測(cè)序、qPCR、細(xì)菌培養(yǎng)）和分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)技術(shù)方法（免疫印跡、qPCR、LC/MS）等，深入揭示腸道菌群在RSV抗AS中的作用及潛在的分子機(jī)制。
　　本研究的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、RSV能顯著抑制模型動(dòng)物AS斑塊形成，腸道菌群在其中有重要作用。
　　高膽堿膳食可顯著促進(jìn)ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成(p＜0.01)，而加入RSV或抗生素后，可明顯減輕高膽堿膳食誘導(dǎo)的AS斑塊形成(

6、p＜0.01);同時(shí)，采用抗生素抑制腸道菌群后，可顯著削弱RSV對(duì)高膽堿膳食誘導(dǎo)的AS的改善作用(p＜0.05)。此外，RSV單獨(dú)處理亦可顯著抑制AS的形成(p＜0.01)。
　　2、RSV能夠通過調(diào)控腸道菌群抑制TMAO生成。
　　(1)RSV可顯著抑制TMAO的生成。
　　RSV可顯著抑制單次或長(zhǎng)期高膽堿膳食引起的血漿TMA和TMAO的生成(p＜0.01);同時(shí)，與普食組比較，RSV單獨(dú)處理亦可顯著降低小鼠血漿TM

7、A和TMAO的含量(p＜0.01)。
　　(2)RSV可顯著改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制腸TMA的生成。
　　RSV可明顯增加擬桿菌（Bacteroides）豐度而降低普雷沃氏菌(Prevotella)豐度(p＜0.05);經(jīng)相關(guān)性分析和多重比較發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌（Prevotella）和擬桿菌（Bacteroides）的豐度與血漿TMA和TMAO水平具有顯著的相關(guān)性(p＜0.05);同時(shí)，RSV可顯著抑制腸道細(xì)菌代謝膽堿產(chǎn)生TMA

8、(p＜0.01)。此外，同一批小鼠在RSV干預(yù)一個(gè)月后，再利用普通膳食洗脫一個(gè)月，RSV對(duì)單次膽堿灌胃引起的血漿TMA和TMAO生成的抑制作用被顯著的減弱(p＜0.01)。
　　結(jié)果表明，腸道菌群在RSV抑制TMAO生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　3、RSV能夠通過調(diào)控腸道菌群影響膽汁酸代謝。
　　(1)RSV能顯著影響膽汁酸代謝，促進(jìn)肝臟膽汁酸合成，維持膽固醇的代謝平衡。
　　RSV可降低小鼠肝臟膽固醇的含量、增加膽

9、汁酸池大小、促進(jìn)糞便膽汁酸的外排、減少小腸腸壁組織中膽汁酸的含量、增加膽汁和腸道內(nèi)膽汁酸的含量(p＜0.01)，而對(duì)血漿和肝臟組織中的膽汁酸水平?jīng)]有顯著影響(p＞0.05);同時(shí)，RSV還能增加膽汁TCA/TβMCA的比值、促進(jìn)肝臟CYP7A1的表達(dá)(p＜0.01)。
　　(2)RSV可顯著改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)肝臟膽汁酸合成。
　　RSV可顯著增加乳酸桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacteri

10、um）的豐度，從而增加腸道膽汁酸水解酶活性，以促進(jìn)膽汁酸在腸道的分解代謝，進(jìn)而促進(jìn)糞便膽汁酸的外排，最終促進(jìn)膽汁酸在肝臟的合成。同時(shí)，使用抗生素抑制腸道菌群后，RSV對(duì)肝臟膽汁酸合成的促進(jìn)作用被顯著削弱(p＜0.05)。
　　結(jié)果表明，腸道菌群在RSV調(diào)節(jié)膽汁酸代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　4、RSV通過抑制腸肝FXR/FGF15軸促進(jìn)肝臟膽汁酸合成。RSV能顯著抑制腸道FGF15的表達(dá)(p＜0.01)，而對(duì)腸FXR和肝FXR/

11、小異二聚體伴侶(SHP)的表達(dá)沒有顯著作用(p＞0.05)。FXR抑制劑作用后，RSV不能進(jìn)一步的抑制FGF15表達(dá)和促進(jìn)肝CYP7A1表達(dá);而FXR激動(dòng)劑可逆轉(zhuǎn)RSV引起的FGF15表達(dá)減少和CYP7A1表達(dá)增加。這些結(jié)果提示，腸肝FXR/FGF15軸在RSV調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸合成中發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述，RSV能夠通過改變腸道菌群結(jié)構(gòu)減少TMAO的生成;同時(shí)，通過影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制腸肝FXR/FGF15軸，促進(jìn)肝臟膽汁酸