去甲腎上腺素對腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核神經(jīng)元活動的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、中樞去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)能系統(tǒng)在多種重要的生理功能中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。腦干中的藍斑核(locus coeruleus，LC)是中樞NA的主要來源。盡管NA能神經(jīng)元的分布主要位于腦干當中，但由這些神經(jīng)元所發(fā)出的纖維廣泛投射至包括脊髓在內(nèi)的整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在中樞的不同腦區(qū)當中，主要存在三種受體，包括α1、α2以及β受體，介導(dǎo)了NA對不同腦區(qū)神經(jīng)元活動及相關(guān)功能的調(diào)控。然而，鑒于其受體種類繁多，并且分布模式以

2、及激活后對神經(jīng)元活動的影響均呈現(xiàn)出多樣性，NA參與不同生理功能的細胞分子機制也十分復(fù)雜多樣，并因此引起了廣泛的關(guān)注。
　　腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核(caudal pontine reticular nucleus，PnC)是mPMRF的重要組成部分，PnC中的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元介導(dǎo)了震驚運動(startle)這一姿勢調(diào)節(jié)運動。已有研究表明，在PnC中微量注射NA可以對大鼠震驚反射運動行為的幅度產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用，據(jù)此我們推測NA可能通過調(diào)控Pn

3、C網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元，參與其介導(dǎo)的中樞運動功能調(diào)節(jié)?；仡櫸墨I，目前尚無NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動調(diào)控機制的報道。因此，本文綜合采用形態(tài)學(xué)、全細胞膜片鉗以及神經(jīng)藥理學(xué)技術(shù)，在細胞水平系統(tǒng)探索了NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的調(diào)控及機制。主要結(jié)果如下:
　　1.α1以及α2受體共表達于單個PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，其激活共同介導(dǎo)了NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動的影響。
　　為了明確NA作用于PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的電生理效應(yīng)，

4、我們將其鉗制在-70 mV，觀察短暫(3 min)灌流3μM的NA引起的全細胞電流變化。研究結(jié)果表明，NA(3μM)在一部分PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中誘發(fā)內(nèi)向電流反應(yīng)(82/135例，60.7％)，而在另一部分PnC神經(jīng)元中誘發(fā)外向電流反應(yīng)(53/135例，39.3％)。無論是NA誘發(fā)的內(nèi)向(P=0.364，n=6)還是外向(P=0.511，n=6)電流反應(yīng)，均不受TTX(1μM)的影響，提示突觸后的NA能受體介導(dǎo)了NA的效應(yīng)。結(jié)合藥理學(xué)手

5、段研究后發(fā)現(xiàn)，NA所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應(yīng)可以被低濃度α1受體阻斷劑prazosin(Pra，0.01μM)部分阻斷(P＜0.05，n=7)，但高濃度的Pra(10μM)使NA在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向外向電流反應(yīng)。只有同時加入Pra(10μM)以及α2受體阻斷劑yohimbine(Yh，10μM)方可完全阻斷NA(3μM)對該神經(jīng)元全細胞電流的影響(P＜0.01，n=7)。應(yīng)用同樣方法研究后發(fā)現(xiàn)，NA所誘發(fā)的外向電流反應(yīng)可以被低濃度α2

6、受體阻斷劑Yh(0.01μM)部分阻斷(P＜0.01，n=6)，但高濃度的Yh(10μM)使NA在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向電流反應(yīng)。只有同時加入Pra(10μM)以及Yh(10μM)方可完全阻斷NA(3μM)對該神經(jīng)元全細胞電流的影響(P＜0.01，n=6)。上述結(jié)果表明，PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后共表達有α1和α2受體，其激活在電壓鉗鉗制于-70 mV的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中分別介導(dǎo)了內(nèi)向和外向電流成分，兩者經(jīng)過不同整合后，表現(xiàn)為N

7、A在一部分神經(jīng)元誘發(fā)內(nèi)向電流，而在另一部分誘發(fā)外向電流。與此相一致的是，免疫熒光雙標結(jié)果表明，α1A和α2A受體亞型共表達于PnC中胞體直徑大于35μm的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中。
　　2.突觸后α1和α2受體的激活，分別增加和抑制同一PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電活動。
　　本實驗中灌流的ACSF中加入了CNQX(10μM)、AP5(20μM)和picrotoxin(100μM)，以阻斷PnC中的主要興奮及抑制性突觸傳遞。在此基礎(chǔ)上，

8、我們于電流鉗模式(I=0)模式，直接記錄PnC網(wǎng)站脊髓神經(jīng)元的放電活動。在該條件下，所有記錄的6例神經(jīng)元均表現(xiàn)出自發(fā)放電活動(平均放電頻率:4.5±1.5 Hz;頻率變化范圍:1.7～11.6 Hz)。ACSF灌流α1受體的激動劑phenylephrine(PE，100μM)顯著增加了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(P＜0.05;n=6);而在同一個的神經(jīng)元中，ACSF灌流α2受體的激動劑則顯著降低了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(P＜

9、0.05;n=6)。該結(jié)果不僅進一步確認了實驗室前期電壓鉗實驗的結(jié)果，更進一步揭示了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1以及α2受體的激活可以在神經(jīng)元活動層次對神經(jīng)元興奮性分別起到相反的動態(tài)調(diào)節(jié)作用。
　　3.PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1和α2受體激活分別偶聯(lián)的離子通道機制。
　　在全細胞膜片鉗電壓鉗條件下，應(yīng)用緩慢的斜坡電壓(slowramp)刺激(-125 mV～+5mV，dV/dt=+10 mV/s)，我們可以得到α1以及

10、α2受體激動劑在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元上所誘導(dǎo)的凈電流的電流-電壓關(guān)系曲線(I-V relationship curve)。
　　(1)突觸后α1受體的激活，通過開放下游非選擇性陽離子通道調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動。
　　通過分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PE(100μM)激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0 mV;n=15)接近于文獻報道的非選擇性陽離子通道電導(dǎo)(nonselective cationicco

11、nductance，NSCC)的平衡電位。并且在測試電壓范圍內(nèi)其I-V曲線均呈現(xiàn)出正向斜率，提示該通道開放介導(dǎo)了α1受體激活對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的興奮性調(diào)控效應(yīng)。進一步應(yīng)用離子置換實驗降低胞外Na+濃度(由152.5 mM降至70 mM)不僅顯著降低了α1受體激活后引起的凈電流大小(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=40;70 mM Na+:n=11)，α1受體激活所得到的凈電流的平衡電位也符合預(yù)期的向更負的方向移動(-42

12、.9±4.2 mV;P＜0.05;152.5 mMNa+:n=15;70mMNa+: n=9)。上述結(jié)果表明，α1受體激活后可以激活NSCC，調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動。文獻報道NSCC主要包含Na+以及K+成分，進一步應(yīng)用翻轉(zhuǎn)電位以及戈德曼-霍奇金-卡茨方程(Goldman-Hodgkin-Katz equation)計算得出在不同胞外Na+濃度下的Na+/K+通透比例后發(fā)現(xiàn)，在兩種情況下其比例并無顯著差異(P=0.702;n=9)

13、。該結(jié)果表明，α1受體激活后可能僅與NSCC相偶聯(lián)。
　　(2)突觸后α2受體的激活，通過關(guān)閉非選擇性陽離子通道和開放K+通道調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動。
　　激活α2受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-23.5±4.3 mV;n=10)同樣接近于NSCC的平衡電位但略高于激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0mV;n=15)。此外，在其中3列神經(jīng)元中，除接近于NSCC平衡電位的交點外，激

14、活α2受體所得到的凈電流同時還存在接近K+平衡電位的交點(mean:-99.3±4.3 mV)。該結(jié)果提示，與α1受體不同，α2受體下游可能同時偶聯(lián)了NSCC以及K+電導(dǎo)。進一步的離子置換實驗表明，胞外Na+濃度由152.5 mM降至70 mM顯著減弱了α2受體激活后所引起的凈電流幅度(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=25;70 mM Na+:n=10)。與此同時，胞外Na+濃度由152.5 mM將至70 mM后，α2受體激

15、活后所引起的凈電流在絕大多數(shù)測試的神經(jīng)元(n=6/7)中均呈現(xiàn)出兩個平衡電位:-109.9±4.7 mV(依然接近于K+平衡電位，并且在低Na+條件下出現(xiàn)概率增大)和-28.2±1.0 mV(明顯高于低Na+條件下NSCC平衡電位的期待值，該期待值來自低Na+條件下α1受體激活后的平衡電位，-42.9±4.2mV)。值得注意的是，在剩下的1個神經(jīng)元中，α2受體激活后所引起的凈電流僅呈現(xiàn)出一個平衡電位，-44.0 mV，接近于低Na+條件

16、下NSCC平衡電位的期待值。該結(jié)果表明，α2受體激活偶聯(lián)了K+通道，并且K+通道的活動可能顯著影響在低Na+(70 mM)條件NSCC平衡電位的觀測值，并使其向更正的方向移動。的確，在ACSF中加入K+通道廣譜阻斷劑Ba2+后，α2受體激活后引起的凈電流幅度進一步顯著減少(P＜0.05;70 mM Na+:n=10;1 mM Ba2+:n=6)，并且此時α2受體激活后引起的凈電流平衡電位僅存在一個，-44.7±1.3 mV(n=6)，與

17、上述低Na+條件下NSCC平衡電位的期待值也不在存在顯著差異(P=0.370)。該結(jié)果表明，α2受體激活后可以同時偶聯(lián)K+以及NSCC兩種電導(dǎo)。并且在阻斷鉀離子后計算α2受體偶聯(lián)NSCC的Na+/K+通透比與α1受體所偶聯(lián)NSCC的Na+/K+通透比并不存在顯著差異(P=0.671;α1:n=24;α2:n=6)，進一步說明兩者偶聯(lián)的為同一類NSCC通道。對α2受體激活引起的凈電流I-V關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，其在接近K+平衡電位呈現(xiàn)出正向斜率而