宮外生長(zhǎng)遲緩對(duì)肺血管影響及傳代效應(yīng)的表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、目的：生命早期是個(gè)體發(fā)育的關(guān)鍵窗口期(critical window)，關(guān)系到整個(gè)生命周期的發(fā)育及健康，甚至可影響到子孫后代。自上世紀(jì)末Barker假說(shuō)的提出后，大量流行病學(xué)以及實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)證實(shí)在這一時(shí)期營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的改變是導(dǎo)致個(gè)體成年期心血管代謝性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的誘因，并且這種效應(yīng)可影響到子一代，子二代甚至一直遺傳下去。宮外生長(zhǎng)遲緩（Extrauterine growth restriction，EUGR）指嬰兒生后的生長(zhǎng)發(fā)育各計(jì)量指

2、標(biāo)（身長(zhǎng)、體重等）在相應(yīng)宮內(nèi)生長(zhǎng)速率期望值的第10百分位以下（≤生長(zhǎng)曲線的第10百分位）。根據(jù)我國(guó)目前的出生率和早產(chǎn)發(fā)生率計(jì)算數(shù)據(jù)顯示，每年出生約150萬(wàn)早產(chǎn)兒，其中EUGR發(fā)生率極高。最新的流行病學(xué)及動(dòng)物模型研究顯示EUGR可致成年期體循環(huán)及肺循環(huán)的血管功能發(fā)生改變，如發(fā)生體循環(huán)收縮壓增高，肺動(dòng)脈壓增高，提示成年期心肺血管疾病的發(fā)生可能源于生命早期的營(yíng)養(yǎng)打擊，再一次印證了“多哈理論”即“健康與疾病的發(fā)育起源”(development

3、originof Health and disease，DOHaD)學(xué)說(shuō)。表觀遺傳學(xué)指基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的調(diào)控基因表達(dá)的可遺傳修飾。大量動(dòng)物模型研究證實(shí)表觀調(diào)控機(jī)制在發(fā)育起源的成人疾病，尤其是心血管代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。在發(fā)育可塑期，不良環(huán)境使機(jī)體DNA甲基化、組蛋白修飾發(fā)生變化，改變了一些重要基因的表達(dá)，造成細(xì)胞、器官功能失調(diào)，發(fā)育受限等不良效應(yīng)而最終發(fā)生疾病。這一過(guò)程也稱為發(fā)育編程(development program

4、ming)。一方面，表觀遺傳機(jī)制如DNA甲基化具有穩(wěn)定性。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，這些表觀修飾的改變?cè)谏缙诓涣即驌魰r(shí)已經(jīng)發(fā)生，并且能夠穩(wěn)定持續(xù)至成年期。另一方面，表觀遺傳修飾本身能夠遺傳的特點(diǎn)，使得發(fā)育起源的成人疾病或生命早期的編程效應(yīng)能夠遺傳至子代，并且已經(jīng)在各種傳代動(dòng)物模型研究中得到證實(shí)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EUGR大鼠在成年期發(fā)生肺動(dòng)脈壓增高，肺血管發(fā)生重塑。同時(shí)在血管功能調(diào)節(jié)的重要器官----內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多個(gè)重要基因發(fā)生不同程

5、度的表觀遺傳修飾改變，這與成年期發(fā)生肺血管功能改變密切相關(guān)。但EUGR是否在暴露后早期就已經(jīng)引起表觀修飾改變，影響到肺血管發(fā)育或功能;并且EUGR對(duì)父代肺血管的編程效應(yīng)是否能夠遺傳到子代，影響子代的發(fā)育及肺血管功能。這些問(wèn)題尚不清楚。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：宮外生長(zhǎng)遲緩對(duì)生后早期肺血管密度影響及表觀遺傳機(jī)制研究。
　　目的：大量流行病學(xué)研究及動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)生命早期營(yíng)養(yǎng)不良可引起成年期高血壓、肺動(dòng)脈高壓等疾病。這些心

6、肺血管功能的失調(diào)可以追溯到生命早期不良環(huán)境暴露初期，已經(jīng)引起機(jī)體重要基因的表達(dá)改變，影響到血管功能或結(jié)構(gòu)，如血管密度稀疏。而表觀遺傳機(jī)制如DNA甲基化及組蛋白修飾在其中發(fā)揮了重要作用，并且這些修飾可以持續(xù)到成年期。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，EUGR可引起大鼠成年期肺動(dòng)脈壓增高，本研究旨在明確EUGR是否在大鼠生后早期就已經(jīng)引起肺血管功能或結(jié)構(gòu)的改變，并進(jìn)一步明確可能引起這種效應(yīng)的重要基因表達(dá)及相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。
　　方法：⑴模

7、型建立:正常懷孕SD大鼠安置，將分娩后得到的新生仔鼠在生后24小時(shí)內(nèi)以雌雄1∶1比例隨機(jī)分配到正常組Control（每籠8-10只仔鼠），EUGR組（每籠18-20只仔鼠）。母鼠隨機(jī)分配到每籠喂養(yǎng)仔鼠，予隨機(jī)飲食。僅保留雄性大鼠做后續(xù)研究。⑵肺動(dòng)脈壓評(píng)估:3周離乳雄性SD大鼠，經(jīng)開(kāi)胸插管測(cè)量右心室平均收縮壓。9周成年雄性大鼠，經(jīng)頸靜脈置管術(shù)測(cè)量平均肺動(dòng)脈壓。⑶血管稀疏度評(píng)估:3周及9周大鼠肺組織免疫組化染色，以von-Willebran

8、dfactor(vWF)染色作為血管內(nèi)皮標(biāo)記，在病理切片中對(duì)肺血管進(jìn)行計(jì)數(shù)。⑷免疫磁珠分選法提取肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，熒光定量RT-qPCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1基因及下游基因Hes-1，Hey-1，Hey-2的表達(dá)水平。⑸染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾情況;重亞硫酸鹽測(cè)序分析Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)CG位點(diǎn)的甲基化程度。
　　結(jié)果：①3周

9、離乳大鼠右心室平均收縮壓兩組間無(wú)顯著差異。9周成年期大鼠肺動(dòng)脈平均壓:EUGR組較Control組顯著升高。3周離乳大鼠免疫組化染色顯示，EUGR組肺血管密度低于Control組(P＜0.05)。9周成年大鼠兩組肺血管密度無(wú)顯著差異。②3周及9周EUGR肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1基因表達(dá)較Control組顯著下降，且下游基因Hes-1表達(dá)也顯著下降。③3周及9周Notch1基因近端啟動(dòng)子區(qū)EUGR組蛋白H3K27met3修飾水平較同齡

10、Control顯著增高。3周及9周EUGR組Notch1基因遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)的CG位點(diǎn)較Control組發(fā)生甲基化程度增高。
　　結(jié)論：EUGR引起生后早期肺血管發(fā)育受限及成年期肺動(dòng)脈壓增高，與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1表達(dá)下降密切相關(guān)。而Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾及DNA甲基化發(fā)生改變可能是Notch1表達(dá)下降的潛在機(jī)制，并且這些修飾可持續(xù)到成年期。
　　第二部分：宮外生長(zhǎng)遲緩對(duì)子代成年期肺動(dòng)脈壓的影響及表觀遺傳機(jī)制

11、研究。
　　目的：生命早期不良環(huán)境不僅能夠影響父代成年期健康，引起心血管代謝性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高，而且這種不良效應(yīng)還能夠遺傳到子代。這便是發(fā)育編程的傳代效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化修飾是介導(dǎo)這一過(guò)程的重要分子機(jī)制。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EUGR可致成年期肺動(dòng)脈壓增高，肺血管功能失調(diào)。但這種不良效應(yīng)能否遺傳到子代尚不清楚。
　　方法：⑴傳代模型建立:將成年期F0父代大鼠進(jìn)行兩兩交配后，雌鼠分籠待產(chǎn)，所生的新生鼠根據(jù)其父代父母來(lái)源

12、分為以下4組。母鼠予隨機(jī)飲食。仔鼠出生3周后離乳，按性別分籠予隨機(jī)飲食直至成年期。⑵體重評(píng)估:分別在出生、離乳期3周、成年期9周稱重。⑶肺動(dòng)脈壓評(píng)估:9周成年大鼠，經(jīng)頸靜脈置管術(shù)測(cè)量平均肺動(dòng)脈壓。⑷免疫磁珠分選法提取肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，全基因組甲基化芯片檢測(cè)父代及子代的DNA甲基化修飾情況，結(jié)果運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法分析。
　　結(jié)果：①子代大鼠體重各組之間無(wú)顯著差異。②9周E♂-C早組雌性肺動(dòng)脈壓較C♂-C♀雌性顯著下降(P＜0.00

13、1)，雄性子代肺動(dòng)脈壓末見(jiàn)顯著變化。③全基因組DNA甲基化修飾分析，子代中發(fā)生差異甲基化修飾區(qū)域的數(shù)量較父代顯著減少;父代中與血壓調(diào)控相關(guān)的基因DNA甲基化修飾發(fā)生遺傳丟失;父代與子代差異甲基化修飾的共同區(qū)域預(yù)測(cè)到包含AP2結(jié)合域在內(nèi)的功能motif。
　　結(jié)論：EUGR對(duì)父代肺血管功能的影響能夠遺傳給子代，表現(xiàn)為性別差異遺傳特點(diǎn)的代償表型。從全基因組水平分析兩代的DNA甲基化修飾特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，父代中參與血壓調(diào)控基因的甲基化修飾印跡的