Cr(Ⅵ)和B[a]P對16HBE細(xì)胞的聯(lián)合毒性效應(yīng)及表觀遺傳改變的研究.pdf

1、1、研究背景：
　　 人類的疾病，尤其是各種癌癥，總是與環(huán)境因素有著不可分割的聯(lián)系。我們周圍的環(huán)境日益復(fù)雜，伴隨著的是大量的食品添加劑、農(nóng)藥、家用化學(xué)品等等。這些物質(zhì)通過各種途徑危害著人們的健康，例如通過改變?nèi)祟惣?xì)胞的生物途徑而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的形成。環(huán)境污染物增多的結(jié)果就是每年各種不同癌癥病例的不斷增加。因此，對于這些化學(xué)物質(zhì)是通過怎樣的機(jī)理以及復(fù)雜的途徑導(dǎo)致各種癌癥的形成，引起了世界各地許多科研工作者的高度

2、關(guān)注。雖然目前有許多關(guān)于化學(xué)物質(zhì)暴露水平與致癌相關(guān)的探索性研究獲得了重要成果，但是人們對于致癌的分子機(jī)制以及成因仍然不是很清楚。更關(guān)鍵的是，如何將這些環(huán)境污染物致癌的毒理學(xué)機(jī)制和成因與最終預(yù)防癌癥的發(fā)生聯(lián)系起來。
　　 在后基因時代，表觀遺傳學(xué)在生命科學(xué)領(lǐng)域中普遍受到關(guān)注。表觀遺傳是指沒有DNA序列變化的、可通過有絲分裂和減數(shù)分裂在細(xì)胞和世代間傳遞的基因表達(dá)改變。表觀遺傳學(xué)研究主要涉及DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑以

3、及MicroRNA、SiRNA等。也就是說，與遺傳學(xué)不同，各種表觀遺傳現(xiàn)象不會涉及基因雜合、基因突變或者微衛(wèi)星不穩(wěn)等等，但是也能在細(xì)胞分裂生長時與基因序列一樣傳給分裂細(xì)胞。雖然沒有導(dǎo)致基因序列的變化，但是這些表觀遺傳現(xiàn)象，如DNA甲基化的變化卻會引起基因的表達(dá)發(fā)生變化。這也就可以解釋，在一個多細(xì)胞的組織或器官中，為什么擁有相同基因序列的細(xì)胞會根據(jù)需要發(fā)展成為具有完全不同功能的細(xì)胞。表觀遺傳修飾，例如DNA甲基化以及組蛋白修飾，與染色質(zhì)重

4、組復(fù)合蛋白一起決定了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的凝聚狀態(tài)和基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 癌癥是一種與基因變異和表觀遺傳變異都相關(guān)的疾病。多數(shù)人對于癌癥的理解為，這是一種由于基因變異導(dǎo)致體細(xì)胞失去正常調(diào)控而引起的疾病。這種變異包括堿基替代、插入和切除，以及由于DNA鏈的斷裂造成的序列重組等等。而目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在有絲分裂過程中，伴隨著DNA復(fù)制一同穩(wěn)定繼承下來的表觀遺傳修飾也是引起癌癥的一個因素，例如胞嘧啶甲基化的改變。目前被證實的與表觀遺傳調(diào)

5、控基因而導(dǎo)致腫瘤生成的包括了肺癌、前列腺癌以及乳腺癌等等。盡管表觀遺傳修飾在生命早期就已經(jīng)確定下來了，但是隨著內(nèi)源的或周圍環(huán)境的刺激，其發(fā)生的改變可以是伴隨一生的。通過表觀遺傳這樣一種途徑，外在環(huán)境刺激就影響到了基因的表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此，表觀遺傳修飾的改變有可能是環(huán)境污染物質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤生成的一個關(guān)鍵因素。
　　 六價鉻(Cr(Ⅵ))是工業(yè)上常用的一種材料，在電子產(chǎn)品中就有廣泛的用途，如用于色素中的著色劑及冷卻水循環(huán)系統(tǒng)中，如吸

6、熱幫浦、工業(yè)用冷凍庫及冰箱熱交換器中的防腐蝕劑。但是其毒性很強(qiáng)，可能導(dǎo)致敏感以及造成遺傳性基因缺陷。長期或短期接觸以及吸入時將會有致癌危險，對環(huán)境也有持久性危險。對鉻類產(chǎn)品的研究也發(fā)現(xiàn)鉻暴露容易引起與呼吸相關(guān)的癌癥，如肺癌。苯并芘(benzo(a)pyrene，B[a]P)也是一種強(qiáng)致癌物，可引起肺癌、胃癌、皮膚癌等，屬于多環(huán)芳烴類化合物(PAH)，廣泛存在于煤焦油、煙草燃燒生成的煙霧、油炸食物以及汽車尾氣中。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為第

7、二類A組人類致癌物質(zhì)。
　　 聯(lián)合毒性是環(huán)境毒理學(xué)的一個重要研究方向，即指兩種或兩種以上毒物共同作用于目標(biāo)時其保留或改變各自毒性作用的現(xiàn)象。由于自然環(huán)境的復(fù)雜性，有毒化合物不可能單獨(dú)存在，更多的是兩種或多種化合物共存，它們作用于生物體時往往會因為污染物之間發(fā)生交互作用，產(chǎn)生協(xié)同或者拮抗以及加合的效應(yīng)而表現(xiàn)出與單一作用完全不同的聯(lián)合毒性來。單個污染物的研究雖然具有一定的參考價值，但作為制定環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)以及環(huán)境容量的依據(jù)，就顯得證據(jù)不足

8、，因此混合化合物對機(jī)體的聯(lián)合作用越來越受到人們的重視。而且，由于污染多有伴生性和綜合性的特點(diǎn)，研究幾種環(huán)境污染物的聯(lián)合損傷效應(yīng)更加接近環(huán)境真實性，國際上對于這種聯(lián)合毒性的研究也多有報道。Cr(Ⅵ)和B[a]P都是廣泛存在于環(huán)境中的污染物。目前國際上已經(jīng)開始關(guān)注兩者的聯(lián)合毒性效應(yīng)，因為現(xiàn)代社會同時受到多環(huán)芳烴化合物和重金屬污染的情況已經(jīng)非常普遍了，而Cr(Ⅵ)和B[a]P分別是這兩類物質(zhì)的代表。
　　 本研究為了解Cr(Ⅵ)和B[

9、a]P對于支氣管上皮細(xì)胞的聯(lián)合毒性效應(yīng)，包括遺傳毒性和表觀遺傳修飾變化，分析這兩種環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)，并探討表觀遺傳效應(yīng)在聯(lián)合毒性中所起的作用，為Cr(Ⅵ)和B[a]P的環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)以及容許濃度提供實驗基礎(chǔ)，也為化學(xué)致癌的防治提供新的思路。
　　 2、研究方法：
　　 2.116HBE細(xì)胞的生物學(xué)特征研究、細(xì)胞毒性及氧化損傷的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞6h、12h以及24h

10、，采用CCK-8測定終點(diǎn)，根據(jù)測定結(jié)果確定染毒劑量和染毒時間，最終設(shè)置溶劑對照組(Ctrl)、Cr(Ⅵ)處理組(0.3μM、0.6μM、1.2μM、2.5μM和5μM)、B[a]P處理組(2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM)和聯(lián)合毒物處理組(B[a]P-Cr(Ⅵ):1.2-0.1μM、2.5-0.3μM、5-0.6μM、10-1.2μM和20-2.5μM)共3組15個劑量。比較正常細(xì)胞和染毒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異;用單細(xì)胞凝膠電

11、泳實驗檢測各組細(xì)胞的DNA損傷程度;用熒光定量PCR(Q-PCR)對氧化損傷修復(fù)基因(OGG1、MGMT、MYH、MTH1)和堿基修復(fù)基因(XRCC1、MLH1、MSH6、PARP-1)進(jìn)行檢測。
　　 2.216HBE細(xì)胞的凋亡和周期變化的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞24h，采用流式細(xì)胞儀或單細(xì)胞凝膠電泳實驗檢測細(xì)胞的凋亡情況和周期變化情況，用熒光定量PCR(Q-PCR)對凋亡相關(guān)基因(

12、Caspase3、bax、Bcl-2)進(jìn)行檢測。
　　 2.3整體基因組DNA甲基化的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞24h，采用5-甲基胞嘧啶抗體免疫熒光法和亞硫酸氫鹽修飾法檢測16HBE細(xì)胞整體基因組DNA甲基化的變化趨勢，并用western blot法檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基化結(jié)合蛋白在細(xì)胞中的含量變化。
　　 2.4組蛋白乙?；降臋z測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[

13、a]P以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞24h，采用細(xì)胞免疫熒光法以及western blot法檢測各處理組細(xì)胞的組蛋白H3和H4整體乙酰化水平，并用western blot法檢測組蛋白去乙?；冈诩?xì)胞中的含量變化。
　　 2.5組蛋白生物素化水平的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞24h，采用Western blot法檢測各處理組細(xì)胞的組蛋白生物素化水平，以Q-PCR法和Western blot法檢測組蛋白

14、生物素化相關(guān)蛋白在不同處理組中的表達(dá)變化和在細(xì)胞中的含量變化，并用細(xì)胞免疫熒光法對組蛋白生物素化相關(guān)蛋白在細(xì)胞中的位置進(jìn)行觀察。
　　 3、研究結(jié)果：
　　 3.116HBE細(xì)胞的生物學(xué)特征研究、細(xì)胞毒性及氧化損傷的檢測用不同濃度的Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率呈劑量依賴性降低，且時間越長，細(xì)胞存活率越低。通過形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞形態(tài)完整，呈長形，胞質(zhì)較多，排列較為疏松;而染毒后細(xì)胞呈方

15、形，胞質(zhì)減少，排列非常緊密。
　　 無論是Cr(Ⅵ)、B[a]P還是兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，各項損傷指標(biāo)（尾部DNA％、尾長、尾矩、OTM值）均呈劑量依賴性增高，且隨著染毒濃度的提高，根據(jù)尾矩對細(xì)胞損傷程度分級，高等級損傷的細(xì)胞所占比例越來越大。具體而言，B[a]P導(dǎo)致的細(xì)胞綜合損傷程度最高，Cr(Ⅵ)染毒對細(xì)胞損傷程度最小，但是最高劑量組中重度損傷細(xì)胞所占比例大于其他兩類染毒方式;聯(lián)合染毒對細(xì)胞的綜合損傷程度類似于Cr(Ⅵ)，但是在

16、低劑量時就出現(xiàn)重度損傷細(xì)胞，早于其他兩類染毒方式。
　　 Cr(Ⅵ)促進(jìn)MUTYH和MTH1的表達(dá)，抑制MGMT的表達(dá)，對OGG1的影響不明顯;B[a]P對OGG1、MUTYH和MTH1都有促進(jìn)表達(dá)的作用，同樣抑制MGMT的表達(dá);聯(lián)合染毒的效果偏向于Cr(Ⅵ)染毒，促進(jìn)MUTYH和MTH1的表達(dá)，抑制MGMT的表達(dá)，對OGG1的影響不明顯。
　　 Cr(Ⅵ)對堿基修復(fù)基因的表達(dá)影響不大，高劑量染毒才能導(dǎo)致PARP-1、M

17、LH1和MSH6的表達(dá)顯著提高，而對PARG和XRCC1的表達(dá)幾乎無影響;B[a]P對該類基因的表達(dá)影響非常明顯，最低劑量就可以導(dǎo)致4個基因表達(dá)的升高;聯(lián)合染毒的效果類似于B[a]P，促進(jìn)4個基因的表達(dá)，對XRCC1、MLH1和MSH6的影響都具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 3.216HBE細(xì)胞的凋亡和周期變化的檢測
　　 凋亡檢測結(jié)果顯示，3類染毒方式對細(xì)胞凋亡的影響都相似，與溶劑對照組相比較，低劑量的毒物都能

18、夠引起較高比例的凋亡細(xì)胞產(chǎn)生;隨著染毒劑量的增加，凋亡細(xì)胞的比例逐漸降低。周期檢測結(jié)果顯示，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，細(xì)胞的G1期和G2期逐漸縮短，而S期逐漸加長;B[a]P染毒對細(xì)胞周期影響非常明顯，最低劑量組(2.5μM)就能夠明顯縮短G1期和G2期，延長S期，隨著B[a]P劑量的增加G1期有所延長，而S期有所降低。
　　 Cr(Ⅵ)可以促進(jìn)Caspase3和bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá);而B[a]P同樣促進(jìn)Caspa

19、se3和bax的表達(dá)，但是對Bcl-2的影響不大;聯(lián)合染毒的效果類似于B[a]P，對Caspase3和bax有促進(jìn)作用，而對Bcl-2無明顯影響。
　　 3.3整體基因組DNA甲基化的檢測
　　 低劑量Cr(Ⅵ)染毒可以明顯降低細(xì)胞的整體甲基化程度，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，細(xì)胞整體甲基化程度逐漸回升，而最高劑量組（5μM）的整體甲基化程度較溶劑對照組有顯著性提高;B[a]P可以導(dǎo)致細(xì)胞整體甲基化程度的降低，隨著B[a]

20、P濃度的增加，整體甲基化程度逐漸降低，具有劑量效應(yīng)關(guān)系;低劑量的聯(lián)合毒物降低了細(xì)胞整體甲基化水平，隨著染毒劑量增加，整體甲基化程度逐步回升，在染毒劑量為5-1.2μM時達(dá)到最高，然后再次降低。
　　 Cr(Ⅵ)染毒對Dnmt1的影響不明顯，增加了Dnmt3b在細(xì)胞中的含量，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系，而在最高劑量時才使MBD2的含量有明顯增加;B[a]P染毒明顯增加了Dnmt1和MBD2在細(xì)胞中的含量，而隨著B[a]P濃度的增加，Dnm

21、t3b的含量逐漸減少，具有劑量效應(yīng)關(guān)系;聯(lián)合染毒降低了Dnmt1和MBD2在細(xì)胞中的含量，而增加了Dnmt3b的含量。
　　 3.4組蛋白乙?；降臋z測
　　 隨著Cr(Ⅵ)染毒劑量的提高，H3和H4乙?；街饾u降低。用Western blot法對組蛋白乙?；嚓P(guān)蛋白進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，Cr(Ⅵ)對HDAC2和HDAC3的影響都不大。
　　 但是對于B[a]P處理過的細(xì)胞進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，雖然HDAC2和HDAC3

22、的含量有劑量依賴性的提高，但是H3和H4的整體乙?；阶兓o明顯規(guī)律，并且H4組蛋白乙?；潭冗€略有提高。
　　 Cr(Ⅵ)和B[a]P聯(lián)合處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；乃秸w趨勢是增加的。對相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組相比較，HDAC2和HDAC3的含量在低劑量時有所提高，然后隨著染毒濃度的繼續(xù)提高而逐漸減少，最高劑量組(20，2.5μM)的含量變化較對照組明顯。
　　 3.5組蛋白生物素化水平的檢測

23、　　 BTD在細(xì)胞中的含量變化隨著Cr(Ⅵ)濃度的提高而顯著性降低，但是HCS的含量卻幾乎沒有變化。在正常細(xì)胞中BTD蛋白均勻分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，隨著BTD含量的降低，細(xì)胞質(zhì)中的BTD越來越少，大多集中到了細(xì)胞核中，最后基本上只有在細(xì)胞核中才能發(fā)現(xiàn)BTD。而HCS在正常細(xì)胞中也幾乎絕大部分存在于細(xì)胞核之中，由于在Cr(Ⅵ)處理過程中HCS的含量沒有變化，所以在其他Cr(Ⅵ)處理組中HCS的位置也沒有什么變化，都集中在細(xì)胞核中。

24、r>　　 B[a]P染毒后，細(xì)胞中HCS蛋白含量幾乎沒有變化，而BTD的含量隨著B[a]P濃度的提高而降低。經(jīng)B[a]P染毒的細(xì)胞其組蛋白生物素化水平是隨著B[a]P濃度的提高而逐漸升高的，到B[a]P濃度為10μM時達(dá)到最高，然后開始降低。
　　 Cr(Ⅵ)和B[a]P聯(lián)合處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，HCS在細(xì)胞中的含量隨聯(lián)合毒物濃度的提高而顯著提高，而BTD的含量在降低到一定程度后又開始回升。雖然BTD和HCS在細(xì)胞中的含量變化與Cr

25、(Ⅵ)單獨(dú)處理時不同，但是組蛋白生物素化的水平變化趨勢卻是類似的。
　　 4、結(jié)論：
　　 4.1 Cr(Ⅵ)暴露對細(xì)胞的損傷主要是因為其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列還原反應(yīng)導(dǎo)致過量自由基產(chǎn)生，而其最終產(chǎn)物Cr(Ⅲ)與DNA形成加合物導(dǎo)致的損傷所占比例不大。Cr(Ⅵ)單獨(dú)暴露所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷要弱于B[a]P，但是兩者聯(lián)合處理時Cr(Ⅵ)占據(jù)主導(dǎo)地位。
　　 4.2聯(lián)合染毒對細(xì)胞凋亡的影響與兩者單獨(dú)處理時沒有差別，低劑量時細(xì)

26、胞凋亡程度顯著增加，高劑量時凋亡程度降低。經(jīng)Cr(Ⅵ)和B[a]P染毒后，周期停滯時期主要發(fā)生在S期。聯(lián)合染毒對細(xì)胞周期的影響結(jié)果也與Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理時情況一致。
　　 4.3低劑量Cr(Ⅵ)降低了細(xì)胞的整體甲基化水平，導(dǎo)致染色質(zhì)穩(wěn)定性失衡以及基因印跡丟失。高劑量B[a]P可以降低細(xì)胞的整體甲基化水平。Cr(Ⅵ)和B[a]P聯(lián)合處理細(xì)胞時對DNA甲基化水平的影響沒有顯著性變化。
　　 4.4 Cr(Ⅵ)可以降低細(xì)胞組蛋