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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
苯被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和日常生活,暴露難于避免。盡管苯主要損害造血系統(tǒng),但苯的雄性生殖毒性也被一些研究所報(bào)道。目前已觀察到苯接觸工人的精子數(shù)量下降,異常形態(tài)精子比例增加,精子DNA損傷,非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)畸變精子的比率增加等現(xiàn)象。毒理學(xué)研究也顯示,亞慢性苯吸入暴露可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠的精子濃度降低、活力下降,提示苯對(duì)精子生成具有明確的毒性作用。然而,苯對(duì)生精過(guò)程不同階段的影響特征還不清楚。表觀遺傳學(xué)(epigenetics
2、)的興起,為苯毒性機(jī)制研究提供了新的視角和方向。其中,DNA甲基化與MicroRNA(miRNA)調(diào)控是表觀遺傳調(diào)控的主要內(nèi)容,并且在睪丸發(fā)育及精子生成等過(guò)程中也起著重要的調(diào)控作用。本研究通過(guò)檢測(cè)亞慢性苯暴露對(duì)小鼠精子生成的損傷狀況,以揭示苯對(duì)生精過(guò)程的損傷特征;并通過(guò)相關(guān)基因甲基化的變化和miRNA的表達(dá)的檢測(cè),以探討苯對(duì)精子生成損傷的表觀遺傳機(jī)制。
材料方法:
1.亞慢性苯吸入染毒:6~8周齡的C57BL/6J雄
3、性小鼠,按體重隨機(jī)分為3組,分別為對(duì)照組、1 ppm和100 ppm苯暴露組。模擬職業(yè)暴露情況,實(shí)施每天8小時(shí),每周5天,共13周的亞慢性動(dòng)式吸入染毒。
2.睪丸病理學(xué)檢測(cè):HE染色觀察睪丸組織病理學(xué)改變。
3.精細(xì)胞marker基因表達(dá)檢測(cè):選取精子發(fā)生中階段特異性表達(dá)基因,作為不同生精階段精細(xì)胞的marker,選定的marker基因有代表A型精原細(xì)胞的Plzf,分化型精原細(xì)胞的Stra8,初級(jí)精母細(xì)胞的Sycp3
4、,圓形精子的Tnp1、Tnp2,長(zhǎng)形精子的Akap4,以及魚(yú)精蛋白Prm1、Prm2,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)睪丸marker基因的mRNA表達(dá)。
4.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)檢測(cè):選取4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt31,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其睪丸組織的mRNA表達(dá)。
5.基因甲基化程度檢測(cè):利用飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)定量檢測(cè)Tnp1、Prm2基因的甲基化水
5、平。
6.miRNA表達(dá)檢測(cè):利用PicTar、TargetScan和MiRanda三個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)基因的靶miRNA。依據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,分別選取了Tnp1的靶miRNA是miR-181b-5p、Tnp2的靶miRNA是miR-122-5p、 Prm1的靶miRNA是miR-484、Prm2的靶miRNA是miR-24-3p,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)睪丸miRNA表達(dá)。
結(jié)果:
1.睪丸病理學(xué)
6、檢測(cè)分析:苯暴露組小鼠睪丸組織呈現(xiàn)嗜酸性染色增強(qiáng),1 ppm組出現(xiàn)少量核溶解和細(xì)胞脫落現(xiàn)象,其病理意義尚不明確;100 ppm組小鼠睪丸生殖細(xì)胞變性、壞死的明顯增多,管腔中心無(wú)(或少)細(xì)胞的曲細(xì)精管數(shù)量明顯增多,表明亞慢性苯暴露可引起小鼠睪丸的病理改變。
2.marker基因表達(dá)分析:與對(duì)照組比較,苯暴露組marker基因Plzf、Stra8、Sycp3、Akap4的mRNA表達(dá)均未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而1 ppm組Prm2的mR
7、NA表達(dá)顯著降低(P<0.01);100 ppm組過(guò)渡蛋白Tnp1、Tnp2,魚(yú)精蛋白Prm1、Prm2的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05),提示苯對(duì)生精的影響主要發(fā)生在單倍體精子階段,可能主要影響精細(xì)胞核內(nèi)組蛋白被魚(yú)精蛋白的取代過(guò)程。
3.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)分析:與對(duì)照組比較,苯暴露組DNA甲基化酶Dnmt1、Dnmt3a的mRNA表達(dá)均未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而100 ppm組Dnmt3b、Dnmt31的mRNA表達(dá)均顯著
8、降低(P<0.01),其中100 ppm組與1 ppm組相比,Dnmt3b的mRNA表達(dá)也顯著降低(P<0.01),表明亞慢性苯暴露對(duì)睪丸DNA甲基化酶的表達(dá)造成干擾,提示可能會(huì)影響基因DNA甲基化程序。
4.基因的甲基化水平分析:Tnp1、Prm2均呈高甲基化狀態(tài),但與對(duì)照組相比,苯暴露組Tnp1、Prm2各甲基化位點(diǎn)的平均甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明苯暴露引起的Tnp1、Prm2基因的mRNA表達(dá)的變化與其DNA甲基化變化無(wú)
9、關(guān)。
5.miRNA表達(dá)分析:與對(duì)照組相比,苯暴露組miR-122-5p、miR-484、miR-24-3p的表達(dá)未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而100 ppm組miR-181b-5p的表達(dá)顯著升高(P<0.01),提示苯暴露引起的Tnp1表達(dá)下降可能與miR-181b-5p的表達(dá)升高有關(guān)。
結(jié)論:
亞慢性苯暴露可導(dǎo)致小鼠睪丸組織的病理改變,降低過(guò)渡蛋白Tnp1、Tnp2和魚(yú)精蛋白Prm1、Prm2的表達(dá),提示可能主要
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