角毛殼菌Chi58基因克隆與密碼子優(yōu)化及在畢赤酵母中的高效表達.pdf

1、角毛殼菌（Chaetomium cupreum Ames）是一種優(yōu)良的生物防治真菌，能有效防治多種植物病原菌引起的病害；幾丁質(zhì)酶是其生防過程中產(chǎn)生并發(fā)揮重要作用的細胞壁水解酶類。以角毛殼菌（C. cupreum）幾丁質(zhì)酶為研究對象，構(gòu)建高效表達幾丁質(zhì)酶的基因工程菌株；并通過密碼子改造、多拷貝整合轉(zhuǎn)化子的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化等方法提高了幾丁質(zhì)酶基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）系統(tǒng)中的表達量。為幾丁質(zhì)酶工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良的基因

2、工程菌株，為研究和開發(fā)新型生物農(nóng)藥奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　在模擬自然環(huán)境條件下，分別以3種植物病原真菌細胞壁誘導(dǎo)角毛殼菌（C. cupreum）細胞壁水解酶類的產(chǎn)生；半定量RT-PCR分析表明，幾丁質(zhì)酶Chi58基因被誘導(dǎo)表達，推測幾丁質(zhì)酶 Chi58基因可能是角毛殼菌（C. cupreum）幾丁質(zhì)酶系的一個重要組分并參與角毛殼菌（C. cupreum）的生物防治作用。因此，本文通過反向 PCR方法克隆了幾丁質(zhì)酶基因 Chi58全長

3、序列，為角毛殼菌（C. cupreum）的生物防治機理的研究奠定基礎(chǔ)。
　　Chi58基因已成功注冊到 GenBank數(shù)據(jù)庫（登錄號為：DQ886936），經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，CHI58包含1個 N端信號肽序列、1個幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)（ChBD）、富含半胱氨酸的連接區(qū)及糖基水解酶18家族催化區(qū)結(jié)構(gòu)域。ChBD與植物幾丁質(zhì)酶中 ChBD的位置及氨基酸組成相似，同屬于 ClassI幾丁質(zhì)結(jié)合域類型。
　　構(gòu)建載體 pYES2-Chi

4、58和 pPIC9K-Chi58分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H158及畢赤酵母（P. pastoris）GS115。經(jīng)酶活性測定表明，在釀酒酵母（S. cerevisiae）表達系統(tǒng)中，幾丁質(zhì)酶活性在誘導(dǎo)后第60h達到最高值，酶活為0.33U；而在畢赤酵母（P. pastoris）中酶活最高值為39U，出現(xiàn)在誘導(dǎo)后第120h，酶活性較釀酒酵母（S. cerevisiae）提高約120倍。
　

5、　SDS-PAGE及 Zymogram驗證了幾丁質(zhì)酶 CHI58被分泌到畢赤酵母（P. pastoris）細胞外大量表達，且具有幾丁質(zhì)酶活性。發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶酶促反應(yīng)最適溫度為45℃；最適 pH值為5.8；在70℃下具有較好的熱穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)化子經(jīng)10代傳代培養(yǎng)后仍具有較高的幾丁質(zhì)酶活性。幾丁質(zhì)酶對可溶性底物（乙二醇幾丁質(zhì)）及不溶性底物（膠態(tài)幾丁質(zhì)、粉末幾丁質(zhì)、羧甲基殼聚糖）降解作用不同，不能降解可溶性的乙二醇殼聚糖。金屬離子及化合物可以影

6、響幾丁質(zhì)酶的活性，其中Ba2+和NH4+對幾丁質(zhì)酶活性的影響最大，使酶活性分別提高了171.2％和80%；而 Mg2+和 K+使酶活性分別提高了21.2%和24.4%；其它金屬離子及化合物對幾丁質(zhì)酶均具有抑制作用，其中 Ca2+、Mn2+和NaN3對酶活的抑制作用最弱。
　　分析影響 CHI58在畢赤酵母（P. pastoris）中表達量的內(nèi)、外因素表明，密碼子改造是提高外源基因表達量的最直接有效地方法。將 Chi58基因中相距較

7、近的5個編碼精氨酸的密碼子 CGC突變?yōu)楫叧嘟湍福≒. pastoris）使用頻率較高的 AGA后，Chi58在畢赤酵母（P. pastoris）中的表達量提高了約3倍。經(jīng)密碼子改造、多拷貝整合篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化后，CHI58的酶活值最高達246.68U，為初始幾丁質(zhì)酶活性的6倍。
　　通過 SOE-PCR方法獲得了幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChBD）缺失突變體，將缺失突變體在畢赤酵母（P. pastoris）中進行表達，結(jié)果表明，ChBD的

8、存在對不溶性幾丁質(zhì)的綁定和吸附具有重要的作用。將缺失突變體的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液濃縮10倍進行體外抑菌試驗，發(fā)酵液對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、楊樹葉枯病菌（Septoria tritici）及稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）具有不同程度的抑制作用，但抑制率較低，最高抑菌率僅為15%；而 Chi58的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液濃縮10倍后，最高抑菌率可達40%。由此說明，缺失幾丁質(zhì)結(jié)合域的幾丁質(zhì)酶對植物病原菌的抑制作用