激活TRPV1促進(jìn)腎臟鈉排泄及降低血壓的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　高血壓是當(dāng)前我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)最為常見的疾病之一，其患病率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。高血壓是冠心病、腦卒中、心力衰竭、腎功能衰竭等疾病的主要危險(xiǎn)因素，也是致殘和死亡的重要原因，其防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。作為高血壓發(fā)病的主要環(huán)境因素之一，高鹽攝入在其中起到了關(guān)鍵性作用。目前我國(guó)在高血壓的人群防治方面已經(jīng)積極倡導(dǎo)限鹽，但因人群依從性差而難以長(zhǎng)期堅(jiān)持和推廣。研究證實(shí)，腎臟正常的尿鈉排泄功能具有穩(wěn)定血容量及維持血壓平穩(wěn)的作用。對(duì)高

2、血壓病人可給予利尿劑進(jìn)行治療，但長(zhǎng)期應(yīng)用有致水、電解質(zhì)紊亂等副作用。因此，深入研究高鹽飲食狀態(tài)下腎臟鈉重吸收的調(diào)節(jié)機(jī)制，探索新的干預(yù)靶點(diǎn)和經(jīng)濟(jì)易行的干預(yù)措施，對(duì)我國(guó)高血壓的防控具有重要意義。
　　體內(nèi)總鈉量決定著細(xì)胞外液量及血容量，是血壓的重要決定因素。正常成人每日產(chǎn)生的原尿達(dá)180L，其中99％以上的水鈉在腎小管和集合管中被重吸收。約10％的鈉在遠(yuǎn)端腎單位（遠(yuǎn)曲小管和集合管）被重吸收，此處是多種激素、信號(hào)分子作用的靶點(diǎn)，其功能變

3、化可導(dǎo)致嚴(yán)重血壓異常。在末段遠(yuǎn)曲小管和集合管有阿米洛利敏感的上皮細(xì)胞鈉通道(ENaC)，是對(duì)尿鈉進(jìn)行最后精細(xì)調(diào)控的部位。ENaC可受賴氨酸缺陷型蛋白激酶(WNK)家族的調(diào)控，在給予高鹽飲食后，與WT相比，WNK1-/-小鼠腎小管上皮ENaC功能明顯減弱。
　　瞬時(shí)受體電位通道香草醛亞族1(TRPV1)是一種非選擇性陽離子通道，它最先發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞，可以被辣椒素所激活。近來研究顯示，TRPV1不僅存在于神經(jīng)細(xì)胞，在腎小管上皮細(xì)胞中也

4、有表達(dá)，并參與腎臟對(duì)水鈉平衡的調(diào)控。而對(duì)于高鹽飲食者進(jìn)行長(zhǎng)期的辣椒素干預(yù)對(duì)其腎臟排鈉及血壓的影響目前還不清楚。因此，本研究以C57BL/6野生型小鼠(WT)和TRPV1基因敲除小鼠(TRPV1-/-)為研究對(duì)象，分別從整體動(dòng)物及細(xì)胞水平的角度，首先證實(shí)小鼠腎臟皮質(zhì)集合管(CCD)及體外培養(yǎng)的M1-CCD細(xì)胞存在功能性TRPV1的表達(dá)，并參與介導(dǎo)膳食辣椒素引起的尿鈉排泄增多;進(jìn)而明確長(zhǎng)期膳食辣椒素干預(yù)通過激活小鼠腎臟皮質(zhì)集合管TRPV1，

5、降低高鹽飲食引起的血壓增高;并進(jìn)一步探討膳食辣椒素促進(jìn)尿鈉排泄的分子機(jī)制并揭示TRPV1在其中的作用。
　　材料與方法:
　　整個(gè)研究分為離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。離體實(shí)驗(yàn)以小鼠腎皮質(zhì)集合管（M1-CCD）細(xì)胞為研究對(duì)象;在體實(shí)驗(yàn)以TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠（美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室）及C57BL/6J（野生型，WT）小鼠為研究對(duì)象，TRPV1-/-小鼠和WT小鼠隨機(jī)分為高鹽組(HS)、普食組(ND)、高鹽加辣椒素

6、組(HSC)予以飲食干預(yù)10月。
　　1.無線遙測(cè)血壓技術(shù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的24小時(shí)動(dòng)態(tài)收縮壓及舒張壓。鼠尾血壓儀每?jī)稍聶z測(cè)小鼠鼠尾血壓。
　　2.代謝籠收集小鼠24小時(shí)尿液，檢測(cè)24小時(shí)進(jìn)水量及尿量，利用電解質(zhì)分析儀檢測(cè)尿鈉、鉀、氯等電解質(zhì)濃度，并計(jì)算24小時(shí)尿鈉排泄量。
　　3.熒光標(biāo)記法檢測(cè)M1-CCD細(xì)胞予以不同濃度NaC1溶液干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)游離鈣及游離鈉的濃度變化。
　　4.蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠長(zhǎng)期飲食干預(yù)后腎

7、皮質(zhì)集合管WNK1、WNK4、SGK1、αENaC、βENaC等關(guān)鍵酶及特定離子通道的表達(dá)變化。
　　5.免疫沉淀法檢測(cè)腎皮質(zhì)集合管細(xì)胞αENaC和TRPV1的相互作用。
　　6.免疫熒光染色法觀察TRPV1和αENaC在M1-CCD細(xì)胞及WT小鼠腎皮質(zhì)集合管上的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.TRPV1和αENaC在M1-CCD細(xì)胞及WT小鼠腎皮質(zhì)集合管上存在共表達(dá)，辣椒素升高胞漿中游離鈣濃度([Ca2+]i)

8、并且呈劑量依賴性。WT小鼠高鹽辣組的24小時(shí)尿鈉排泄量比高鹽組顯著增高，而TRPV1-/-小鼠高鹽辣組則沒有這種作用。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組的24小時(shí)尿量均無明顯差異。
　　2.飲食干預(yù)10個(gè)月后，WT小鼠高鹽辣組24小時(shí)動(dòng)脈收縮壓、舒張壓均顯著低于高鹽組。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組的血漿醛固酮水平均顯著低于普食組。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組的24小時(shí)尿氯排泄量及進(jìn)水量均顯著高于

9、普食組。
　　3.腹腔注射阿米洛利后，WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組24小時(shí)尿鈉排泄量的增加較普食組均顯著增加;WT小鼠高鹽辣組24小時(shí)尿鈉排泄量的增加則明顯低于高鹽組。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽、高鹽辣組腎皮質(zhì)集合管αENaC、βENaC及WNK1、SGK1的蛋白表達(dá)較普食組明顯增加，WT小鼠高鹽辣組腎皮質(zhì)集合管αENaC、WNK1和SGK1的表達(dá)較高鹽組明顯降低，而TRPV1-/-小鼠則沒有變化。
　　4

10、.高鹽溶液能夠降低M1-CCD細(xì)胞TRPV1的表達(dá)，同時(shí)增加αENaC的表達(dá);而辣椒素能夠上調(diào)M1-CCD細(xì)胞TRPV1的表達(dá)，并降低αENaC的表達(dá)，TRPV1特異性阻斷劑iRTX則能夠抑制辣椒素的這種作用。WT小鼠的腎皮質(zhì)集合管中αENaC可與TRPV1產(chǎn)生特異性相互作用。TRPV1特異性抑制劑iRTX能夠明顯減弱辣椒素對(duì)M1-CCD細(xì)胞胞漿鈉攝取的拮抗作用。
　　結(jié)論:
　　1.WT小鼠腎皮質(zhì)集合管及M1-CCD細(xì)胞上