硫化氫對(duì)大鼠腎臟水鈉排泄的作用及其機(jī)制.pdf

1、硫化氫(Hydrogen Sulfide，H2S)是一種無色有臭雞蛋味的氣體，過去一直被認(rèn)為是毒性氣體。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞自身能產(chǎn)生H2S，在正常大鼠的血液中H2S濃度達(dá)到46μmol/L，在腦中H2S濃度高達(dá)100μmol/L。內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚-β-合酶（Cystathionineβ-synthase，CBS）或胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase，CSE)分解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CBS

2、主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，而CSE主要存在于心血管系統(tǒng)中。內(nèi)源性H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均有重要的生理調(diào)節(jié)功能。由于H2S是一種小分子量的氣體分子，能穿透細(xì)胞膜直接起效，在體內(nèi)產(chǎn)生并受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，生理濃度時(shí)有明確的功能并能被外源性氣體模擬，因此，H2S成為繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三個(gè)氣體信號(hào)分子。
　　H2S在正常血壓的維持和調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。研究顯示，內(nèi)源性H2S水平的降低與

3、高血壓的形成有密切關(guān)系，而給予補(bǔ)充外源性H2S有降壓效果，能緩解高血壓的進(jìn)程。腎臟是參與整體血壓調(diào)節(jié)的重要器官，它具有調(diào)節(jié)機(jī)體水鈉平衡的功能，對(duì)正常血壓的維持和調(diào)節(jié)有著重要意義。當(dāng)腎臟的水鈉重吸收功能發(fā)生障礙時(shí)，機(jī)體的血壓會(huì)明顯升高。近年來，鹽與高血壓的密切關(guān)系已逐漸引起人們的重視。高鹽的攝入會(huì)影響正常生理狀態(tài)下鈉的動(dòng)態(tài)平衡，會(huì)直接導(dǎo)致腎臟水鈉潴留，引起高血壓。由此可見，腎臟水鈉排泄障礙和水鈉潴留是高血壓形成的重要機(jī)制，多年來排鈉利尿劑

4、也已成為臨床上治療高血壓病的有效藥物，因此，研究腎臟水鈉排泄的調(diào)節(jié)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　在腎臟組織中，含有豐富的催化內(nèi)源性H2S產(chǎn)生的酶CBS和CSE，它們主要位于腎皮質(zhì)近端小管。而腎臟調(diào)節(jié)水鈉排泄的主要部位就在腎皮質(zhì)近端小管，已知約有70％的水和鈉是在近端小管被重吸收的，因此提出H2S有可能影響腎臟水鈉排泄的設(shè)想。然而目前H2S在腎臟組織中的生理功能還不十分清楚，僅在2009年有一篇文獻(xiàn)報(bào)道H2S可能參與腎組織血流動(dòng)力學(xué)

5、和排泄方面的功能調(diào)節(jié)。因此，本文通過對(duì)H2S在腎臟水鈉排泄方面的研究，將更深入地認(rèn)識(shí)這個(gè)新的氣體信號(hào)分子。
　　首先，觀察H2S對(duì)正常SD大鼠腎臟水鈉排泄的作用。實(shí)驗(yàn)中，使用硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的供體，選擇一分鐘勻速靜脈注射的方式，盡量保持平均動(dòng)脈壓(MAP)和腎動(dòng)脈血流量（RBF）的穩(wěn)定，使其不會(huì)直接影響腎臟水鈉排泄的作用。給予正常SD大鼠一分鐘勻速靜脈注射20μmol/kg的NaHS，檢測其尿量(UV)、排鈉量(UN

6、aV)、排鉀量(UKV)和排氯量(UClV)，結(jié)果顯示H2S能促進(jìn)正常SD大鼠的腎臟排鈉排鉀，且不伴有腎血流量的改變。
　　其次，觀察H2S對(duì)鹽負(fù)荷大鼠腎臟水鈉排泄的作用。通過建立急性鹽負(fù)荷和慢性鹽負(fù)荷兩種大鼠模型，研究在病理狀態(tài)下，H2S能否促進(jìn)水鈉排泄，并緩解高血壓的形成。給予SD大鼠勻速靜脈注射5％NaCl溶液1小時(shí)，建立急性鹽負(fù)荷大鼠模型，接著一分鐘勻速靜脈注射不同濃度NaHS(5，10，20，30，60，90μmol/k

7、g)，觀察H2S對(duì)其血流動(dòng)力學(xué)和排泄方面的影響。結(jié)果顯示H2S對(duì)MAP、RBF和腎小球?yàn)V過率(GFR)等血流動(dòng)力學(xué)方面沒有影響，而在排泄方面，10和20μ mol/kg的NaHS能促進(jìn)急性鹽負(fù)荷大鼠腎臟排鈉、排鉀和排氯，對(duì)尿量沒有影響。之后進(jìn)一步檢測了血漿醛固酮(ALD)和抗利尿激素（ADH）的水平，結(jié)果顯示H2S對(duì)這兩種激素的水平?jīng)]有影響。
　　然后，通過皮下注射醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和飼飲鹽水的方法，建立DOCA-Salt

8、高血壓大鼠(DHR)模型作為慢性鹽負(fù)荷大鼠模型。在造模的同時(shí)，預(yù)防性（即在血壓沒有升高之前）的給予大鼠腹腔注射不同濃度NaHS(10、30、60μmol/kg/d)8周，觀察H2S對(duì)其MAP和排泄方面的影響。結(jié)果顯示，8周時(shí)，H2S能使MAP升高的幅度降低，緩解高血壓的形成;而10μmol/kg的NaHS在4周時(shí)能促進(jìn)慢性鹽負(fù)荷大鼠腎臟排水、排鈉、排鉀和排氯。之后同樣檢測第4周時(shí)慢性鹽負(fù)荷大鼠血漿ALD和ADH的水平，結(jié)果顯示H2S對(duì)這

9、兩種激素沒有影響。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明H2S能促進(jìn)鹽負(fù)荷大鼠腎臟的水鈉排泄，且不伴有腎血流量、腎小球?yàn)V過率和血漿ALD、ADH的改變，提示H2S促進(jìn)腎臟水鈉排泄的作用部位很可能在腎小管。而在腎小管上影響水鈉重吸收的是離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中最主要的就是鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase，Na+泵)。因此，通過分離慢性鹽負(fù)荷大鼠的腎小管上皮細(xì)胞和檢測Na+-K+-ATPase的活性，發(fā)現(xiàn)H2S能抑制慢性鹽負(fù)荷大鼠腎小管上皮細(xì)胞膜Na

10、+-K+-ATPase的活性。推測H2S通過直接抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的活性，抑制腎小管對(duì)Na+的重吸收，從而產(chǎn)生促進(jìn)水鈉排泄的作用。此機(jī)制有待于在細(xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證。另外，通過比較H2S促進(jìn)正常SD大鼠和急慢性鹽負(fù)荷大鼠腎臟排鈉排鉀作用的差別，發(fā)現(xiàn)H2S在病理狀態(tài)下，促進(jìn)排鈉排鉀的作用更強(qiáng)，具有一定的臨床意義。
　　為了進(jìn)一步探討H2S促進(jìn)大鼠腎臟水鈉排泄的作用機(jī)制，本文通過分離大鼠腎小管上皮細(xì)胞作原代培

11、養(yǎng)，研究H2S是否可直接調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給予NaHS可直接抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的活性，印證了本文前面的推測，即H2S可直接抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+泵的功能，抑制腎小管對(duì)Na+的重吸收，從而產(chǎn)生排鈉利尿作用。那么，H2S是如何抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的呢？通過檢測細(xì)胞cAMP、cGMP、PKA和PKC的活性以及PKA和PKC的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)H2S對(duì)它們沒有影響

12、。之后Western blot結(jié)果顯示H2S能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子PI3K和Akt的磷酸化，并具有時(shí)間和濃度依賴性，用PI3K的阻斷劑LY294002和wortmannin能夠阻斷H2S引起的Akt磷酸化。預(yù)先給予細(xì)胞PI3K的阻斷劑或者用顯性負(fù)表達(dá)的Akt質(zhì)粒(DN-Akt)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，H2S抑制Na+-K+-ATPase的效應(yīng)被阻斷，說明H2S抑制細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的效應(yīng)可能通過PI3K/Akt通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H2S

13、既能使Na+-K+-ATPaseα1亞基發(fā)生酪氨酸磷酸化(Tyr10)，也能使ERK的磷酸化水平增加，提示Na+泵α1亞基和ERK也可能參與H2S對(duì)細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的調(diào)控。
　　最后，研究H2S除了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用之外，是否有可能直接與Na+-K+-ATPase結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用呢？選用純化的Na+-K+-ATPase與NaHS直接反應(yīng)，結(jié)果顯示，H2S能提高純化Na+-K+-ATPase的活性，并且這種效應(yīng)具有

14、時(shí)間和濃度的依賴性，考慮可能的原因是純化Na+-K-ATPase的組織差異、種屬差異以及構(gòu)象的改變。為了進(jìn)一步探索H2S與Na+-K+-ATPase之間的相互作用，本文通過AutoDock軟件對(duì)H2S與Na+-K+-ATPase進(jìn)行分子對(duì)接研究。結(jié)果顯示，H2S與Na+-K+-ATPase可能有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中已知的是K+結(jié)合位點(diǎn)，提示H2S可能通過影響K+與Na+-K+-ATPase的結(jié)合而調(diào)節(jié)Na+泵功能。
　　綜上所述，本