姜黃素對腦卒中預(yù)防作用與腎臟多巴胺受體在高血壓發(fā)生中的作用.pdf

1、姜黃素對自發(fā)性卒中型高血壓大鼠腦卒中預(yù)防作用及機制。
　　腦卒中是引起人類致死和致殘的主要原因之一，給個人、家庭、社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響個人的生活質(zhì)量。因此通過對高危人群實施卒中預(yù)防，消除或減少影響高危人群健康的危險因素，顯得尤為重要。近年來可食用類植物對卒中的預(yù)防作用由于其依從性好而且副作用少，因此越來越受到人們的重視。
　　姜黃素（Curcumin）是一種植物多酚，其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括:抗癌、抗氧化、抗

2、炎癥因子、抗血小板聚集、降脂等作用。姜黃素通可過上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)或磷酸化，提高內(nèi)源性一氧化氮的生成，從而改善內(nèi)皮功能。因此姜黃素的這些特性為其預(yù)防腦卒中提供了理論基礎(chǔ)。
　　在我們前期的預(yù)實驗中，與對照組相比，給予姜黃素組大鼠的卒中發(fā)生時間明顯延遲，生存時間明顯延長，而且這種預(yù)防效應(yīng)并非依賴血壓的降低所致。因此姜黃素對腦卒中的預(yù)防作用機制尚不清楚。既往研究表明，血管內(nèi)皮功能在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了

3、至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能紊亂是動脈血管功能障礙的始動因素。血管內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的受損，血管舒張功能的受損明顯增加心腦血管疾病的風(fēng)險。內(nèi)皮源性的一氧化氮是一增加腦血流、保護腦血管的重要內(nèi)源性物質(zhì)，增加內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮的生成可以保護腦缺血區(qū)及縮小梗死面積。因此我們推測姜黃素可能參與降低氧化應(yīng)激水平，保護血管內(nèi)皮細(xì)胞，提高內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮的產(chǎn)量或活性，改善血管舒張功能有關(guān)。
　　解偶聯(lián)蛋白2(

4、UCP2)是位于線粒體內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白家族中一員，其主要功能是參與質(zhì)子轉(zhuǎn)運使氧化磷酸化脫偶聯(lián)，同時也通過介導(dǎo)“質(zhì)子漏”，負(fù)性調(diào)控活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激(oxidative stress)反應(yīng)。UCP2基因敲除小鼠出現(xiàn)動脈粥樣硬化、高血壓、血管舒張功能降低，而過表達(dá)UCP2后能減少因NF-kB激活而導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善血管功能。因此我們推測姜黃素有可能通過上調(diào)UCP2

5、蛋白的表達(dá)來保護內(nèi)皮細(xì)胞，改善血管舒張功能，起到預(yù)防腦卒中的作用。
　　為證實上述假設(shè)，我們以自發(fā)性卒中型高血壓大鼠及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，體內(nèi)外實驗相結(jié)合，主要研究:(1)姜黃素對大鼠卒中發(fā)生時間和生存率影響。(2)姜黃素抗氧化應(yīng)激和改善血管功能的作用。(3)UCP2在姜黃素抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬和凋亡中的作用。
　　1.姜黃素對自發(fā)性卒中型高血壓大鼠腦卒中的預(yù)防作用
　　1.1方法：
　　1.1.1姜黃

6、素對卒中型高血壓大鼠血壓、體重、生存率及卒中發(fā)生時間的影響
　　1.1.2姜黃素對頸內(nèi)動脈血管功能的影響
　　1.1.3觀察姜黃素對椎基底動脈及內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮(NO)，氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響
　　1.1.4姜黃素對頸動脈及內(nèi)皮細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)的影響
　　1.1.5姜黃素對自噬和凋亡的影響
　　1.2結(jié)果：
　　1.2.1姜黃素對實驗大鼠的體重、血壓及腦組織/體重比無明顯影響。
　　與對照組

7、相比，姜黃素飼養(yǎng)組大鼠的血壓有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，2組大鼠質(zhì)量及腦組織質(zhì)量/大鼠質(zhì)量之比也無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　1.2.2姜黃素延遲了卒中型高血壓大鼠卒中發(fā)生時間及提高了大鼠的生存率
　　與對照組相比，姜黃素飼養(yǎng)組大鼠卒中發(fā)生時間明顯延遲，生存率明顯提高，對照組大鼠在實驗開始第2周時出現(xiàn)卒中，在6-8周達(dá)高峰，第3周開始死亡，在7-10周死亡達(dá)高峰期，而姜黃素組大鼠在第3周開始出現(xiàn)卒中現(xiàn)象，在8-10周達(dá)高峰，第3周開始

8、死亡，10-15周死亡達(dá)高峰期。
　　1.2.3姜黃素明顯改善卒中型高血壓大鼠頸動脈血管舒張功能
　　在本部分實驗中，我們檢測了姜黃素飼養(yǎng)組與對照組大鼠的頸動脈舒張功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠頸動脈血管無論是對乙酰膽堿（內(nèi)皮依賴性）或硝普鈉（非內(nèi)皮依賴性）的舒張血管的反應(yīng)均明顯強于對照組，提示姜黃素具有改善血管舒張功能的作用。同時我們也檢測了血管對苯腎上腺素的收縮反應(yīng)，結(jié)果提示兩組大鼠頸動脈血管收縮反應(yīng)并無統(tǒng)計學(xué)意義。

9、　　1.2.4姜黃素增加卒中型高血壓大鼠的頸動脈組織及血液中的一氧化氮含量，降低了氧化應(yīng)激產(chǎn)物，增強了抗氧化能力。
　　在本實驗中我們檢測了卒中型高血壓大鼠頸動脈組織一氧化氮、活性氧簇的含量，與對照組相比，實驗組頸動脈一氧化氮含量明顯增加，而活性氧簇(ROS)顯著減少，同時我們也檢測了血漿中的一氧化氮(NO)、氧化應(yīng)激標(biāo)志物（丙二醛，MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。與對照組相比，姜黃素組大鼠一氧化氮及超氧化物歧化酶含量明

10、顯提高，而氧化應(yīng)激產(chǎn)物顯著減少。結(jié)果提示:姜黃素有明顯的抗氧化能力和增加一氧化氮作用。
　　1.3結(jié)論：
　　1.3.1.姜黃素延遲了卒中型高血壓大鼠卒中發(fā)生時間并且提高了生存率
　　1.3.2.姜黃素改善了卒中型高血壓大鼠的血管舒張功能
　　1.3.3.姜黃素可能同過上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)來發(fā)揮抗氧化，增加細(xì)胞自噬、減少細(xì)胞凋亡來保護內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮生成，改善血管舒張功能，從而達(dá)到預(yù)

11、防卒中的作用。
　　2.腎近曲小管細(xì)胞多巴胺D3受體對多巴胺D4受體影響的機制研究
　　腎臟近曲小管通過對水鈉調(diào)節(jié)而在人體血壓調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，在腎臟中，70％的超濾液及全部的氨基酸及葡萄糖通過腎近曲小管重吸收，而在這一調(diào)控中，腎臟多巴胺受體起到了重要作用。腎臟多巴安受體按其藥理特性及結(jié)構(gòu)分D1類受體(D1、D5受體)及D2類受體（D2、D3、D4受體），所有多巴胺受體直接或間接的參與了對腎臟水鈉及血壓的調(diào)節(jié)。同為D2類

12、受體的腎臟多巴胺D3、 D4受體在腎近曲小管表達(dá)豐富。刺激D3受體腎臟尿鈉排泄增加，多巴胺D3受體基因敲除小鼠腎臟尿鈉排泄下降，血壓升高。D4受體基因敲除小鼠收縮壓及舒張壓均明顯高于正常小鼠，在腎臟近曲小管，刺激D4受體，鈉-鉀-ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性明顯下降。
　　2.1方法：
　　2.1.1放線菌素(cycloheximide，CHX))預(yù)處理細(xì)胞后，免疫印跡法檢測D4受體蛋白的表達(dá)。
　　2.

13、1.2激光共聚焦檢測D3受體及D4受體在腎小管上皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，激光共聚焦和免疫共沉淀方法檢測D3受體及D4受體在腎小管上皮細(xì)胞的共存和物理連接。
　　2.1.3不同信號分子的阻斷劑預(yù)先處理腎小管上皮細(xì)胞后，D3受體激動劑PD128907孵育腎小管上皮細(xì)胞24小時，免疫印跡法檢測D4受體蛋白表達(dá)。
　　2.2結(jié)果：
　　2.2.1 D3受體激動劑抑制WKY腎近曲小管細(xì)胞D4受體蛋白降解
　　在我們的前期實驗中，我們

14、發(fā)現(xiàn)D3受體激動劑PD128907增加WKY細(xì)胞D4受體mRNA和蛋白的表達(dá)，降低了SHR細(xì)胞D4受體mRNA和蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步明確這效應(yīng)的內(nèi)在機制，我們在給予RPT細(xì)胞放線菌素(cycloheximide，CHX))預(yù)處理，再給予PD128907處理細(xì)胞后檢測D4受體表達(dá)，結(jié)果表明:WKY細(xì)胞D4受體蛋白降解速度下降，而SHR細(xì)胞無明顯影響。提示:蛋白翻譯后降解參與了這一效應(yīng)。
　　2.2.2 PD128907增加D4受體對

15、鈉-鉀-ATP酶的抑制作用非受體膜轉(zhuǎn)位依賴性。
　　在我們的前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)D3受體激動劑PD128907增加WKY細(xì)胞D4受體對鈉-鉀-ATP酶的抑制作用，而對SHR細(xì)胞無明顯影響，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):PD128907刺激WKY和SHR細(xì)胞后，胞內(nèi)D3受體和D4受體膜轉(zhuǎn)位并無明顯區(qū)別，提示:PD128907增加D4受體對鈉-鉀-ATP酶的抑制作用非受體膜轉(zhuǎn)位依賴性。
　　2.2.3 D3受體及D4受體在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)

16、存在共存和物理連接現(xiàn)象
　　在這部分實驗中，我們采用激光共聚焦和免疫共沉淀方法觀察了多巴胺D3受體和D4受體在腎近曲小管是否存在共存現(xiàn)象和直接作用，結(jié)果提示:D3受體和D4受體在腎近曲小管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐富且存在共存現(xiàn)象，D3受體激動劑PD128907處理WKY(正常大鼠)細(xì)胞后，D3受體和D4受體的物理連接加強，這一作用在SHR（原發(fā)性高血壓大鼠）腎近曲小管細(xì)胞內(nèi)消失。
　　2.2.4 D3受體對D4受體的功能影響通過PLC/