香莢蘭乙酮對三聚氰胺相關泌尿系結石形成的影響及其機制研究.pdf

1、背景：2007年，美國4000多只狗、貓食用了含有三聚氰胺的飼料而出現(xiàn)腎功能衰竭。2008年，因長期食用含有三聚氰胺的嬰幼兒配方奶粉，我國累計294,000嬰幼兒接受檢查治療，其中住院患兒51,900人，死亡4人，主要是因為三聚氰胺導致了泌尿系結石和腎衰竭。2008年，就診于我院門診的泌尿系結石患兒數(shù)量也明顯增多，這些患兒年齡多在3歲以內，表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、哭鬧、惡心、腹瀉、嘔吐、少尿、無尿、血尿等癥狀，少數(shù)家屬發(fā)現(xiàn)患兒尿液混濁或

2、在患兒尿液中發(fā)現(xiàn)泥沙樣結石排出，通過超聲可以診斷為泌尿系結石。當詢問這些患兒病史時，我們發(fā)現(xiàn)這些患兒都在喂養(yǎng)同一品牌奶粉（三鹿牌嬰幼兒配方奶粉）。隨后，我院泌尿外科將該事件及時上報省衛(wèi)生廳。并針對這一社會重大熱點問題，采用流行病學方法探討了嬰幼兒發(fā)生三聚氰胺泌尿系結石以及梗阻性急性腎損傷的危險因素。在臨床診治過程中探索了體外沖擊波碎石、手術干預等治療方案，改進了藥物溶石及腎后性急性腎損傷的治療方案，建立了一整套行之有效的診療方法。對部分

3、患兒進行了1到3年的跟蹤隨訪，并對不同治療方式的安全性、有效性進行了評價。采用相關物理化學方法，定量測定了患兒結石、血漿及尿液標本中三聚氰胺含量并定性分析了結石的形態(tài)及成分。然而關于三聚氰胺相關泌尿系結石細胞和動物模型的建立及實驗研究在國內外均較少，氧化損傷被認為是普通泌尿系結石形成的重要機制之一，本研究首先建立三聚氰胺相關泌尿系結石細胞和動物模型，之后我們利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶的抑制劑香莢蘭乙酮（apocy

4、nin）對這兩種模型進行干預，為抗氧化損傷預防和治療三聚氰胺相關泌尿系結石提供分子生物學依據(jù)。
　　目的：通過建立三聚氰胺相關泌尿系結石細胞和動物模型，觀察氧化損傷程度、泌尿系結石相關蛋白的表達、動物腎臟組織病理變化、腎臟內結晶的沉積和腎毒性的改變，并預防性和治療性的使用 apocynin，觀察上述指標的變化。從而探討三聚氰胺相關泌尿系結石發(fā)病機制，為泌尿系結石的發(fā)病機制提供相應的理論依據(jù)。
　　方法：在細胞實驗中，通過三聚

5、氰胺和三聚氰酸（melamine and cyanuric acid，MCA）的混合物(600μmol/L，1:1)刺激人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）來建立三聚氰胺相關泌尿系結石的細胞模型。同時預防性或治療性地給予不同濃度的香莢蘭乙酮（apocynin）(0.1或0.2 mmol/L)，當MCA混合物作用HK-2細胞24小時后，收集細胞和培養(yǎng)液，檢測氧化應激（OS）的指標丙二醛(MDA)、8-異前列腺素（8-IP）及超氧化物歧化酶

6、(SOD)。同時用免疫印跡（Western blotting）的方法半定量檢測泌尿系結石相關蛋白骨橋蛋白（OPN）和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表達情況。在動物實驗中，通過給予MCA混合物(400 mg/day/kg，1:1)誘導雄性SD大鼠三聚氰胺相關泌尿系結石的形成。同時預防性或治療性地給予不同濃度的香莢蘭乙酮（0.2或0.4 g/kg/day），造模28天后，對大鼠和其腎臟進行稱重，并收集大鼠的尿液、血液和腎臟，檢測OS和腎毒

7、性（絕對腎重量、相對腎重量、尿素氮和血肌酐）的指標，對大鼠一側腎臟用20％的甲醛進行固定并進行HE染色石蠟切片，普通光學顯微鏡下觀察大鼠腎臟的病理變化及結晶的形成情況并進行評分。并用激光共聚焦顯微鏡對沒有 HE染色透明的石蠟切片內的結晶進行觀察。同時用免疫組織化學的方法對腎組織切片進行免疫組化染色，觀察泌尿系結石相關蛋白OPN和p-p38 MAPK的表達情況，用Western blotting的方法對這兩種蛋白進行半定量。
　　結

8、果：在細胞實驗中，被MCA混合物誘導的HK-2細胞中，OS指標、OPN和p-p38 MAPK兩種泌尿系結石相關蛋白表達都是增高的，當預防性的給予apocynin后，上述指標下降（p<0.05）.但是當治療性的給予apocynin后，OS指標下降（p<0.05），但結石相關蛋白OPN和p-p38沒有顯著的變化（p>0.05）。在動物實驗中，MCA混合物誘導的三聚氰胺相關泌尿系結石 SD大鼠腎毒性、腎臟病理變化評分、腎結晶評分、OS指標以及