Akt2與HBV DNA水平相關性及其機制研究.pdf

1、目的：本實驗的主要目的是研究慢性乙肝病毒性肝炎患者Akt2基因與乙肝病毒載量的關系；探究HBV DNA對Akt2表達的影響；構(gòu)建并評價慢病毒介導的RNA干擾在人HepG2.2.15中的基因沉默效應及沉默后乙肝患者中HBV DNA表達情況。
　　方法：收集240例乙肝患者及80名健康人的外周血，利用熒光定量PCR檢測乙肝患者血中HBV的病毒載量，將實驗對象分為三組，根據(jù)HBV DNA病毒載量的高低：將患者分組，HBV DNA＞1×1

2、07拷貝/ml定為高病毒載量組、1×105拷貝/ml≤HBV DNA≤1×107拷貝/ml定為中病毒載量組，HBV DNA＜1×105拷貝/ml定于低病毒載量組。ELISA法檢測4組外周血的Akt2的含量；比較四組中Akt2的表達差異；培養(yǎng)HepG2及HepG2.2.15細胞，并提取兩類細胞中的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR法（RT-PCR）檢測兩類細胞中Akt2 mRNA的表達水平；設計Akt2的RNAi寡聚核苷酸

3、序列；慢病毒載體構(gòu)建Akt2的shRNA載體，轉(zhuǎn)染入大腸桿菌并觀察重組表達狀況；得到重組腺病毒需要利用293T細胞包裝；綠色熒光蛋白（GFP）作為標記，逐孔稀釋法確定轉(zhuǎn)染效率及滴度；以實時熒光定量法比較各組對Akt2mRNA的干擾效果。最后采用ELISA法檢測實驗組與對照組HepG2.2.15細胞上清液中Akt2的表達水平。
　　結(jié)果：80例健康人血清Akt2的含量為292±15ng/ml；低病毒載量組的80例患者其血清Akt2的

4、含量為378±21ng/ml；中病毒載量組的80例患者血清Akt2的含量為537±18ng/ml，而高病毒載量組的80例患者血清中Akt2含量為622±12ng/ml。CHB患者的不同病毒載量組間及與健康對照組對比，其差異均有統(tǒng)計學意義（P1,2,3<0.001）；HepG2.2.15細胞中Akt2 mRNA的表達水平較HepG2高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；篩選了所構(gòu)建的3個Akt2靶向序列，包裝shRNA慢病毒后轉(zhuǎn)染HepG

5、2.2.15細胞并檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后的沉默效率（效率達到85％），比較得出沉默效率最高的靶序列和工作條件。在細胞培養(yǎng)上清液中，實驗組的HepG2.2.15細胞上清液HBV DNA病毒載量為3.63×106拷貝/ml，而對照組中上清液HBV DNA病毒載量為5.17×106拷貝/ml。兩組的差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。
　　結(jié)論：慢性乙型肝炎患者血清Akt2的含量與HBV DNA載量密切相關；HBV能夠在mRNA和蛋白水平上調(diào)肝癌