苦參堿對大腸埃希菌外膜蛋白A表達(dá)量影響的作用研究.pdf

1、第一部分不同抑菌濃度苦參堿對大腸埃希菌外膜蛋白A表達(dá)量的影響
　　目的:
　　本實驗采用LB肉湯—腹膜透析外接硅膠管系統(tǒng)建立大腸埃希菌體外細(xì)菌生物膜模型，探討在大腸埃希菌生物膜早、中、晚期，不同抑菌濃度的苦參堿對大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)表達(dá)量的影響。
　　方法:
　　用二倍稀釋法分別測量苦參堿和左氧氟沙星對大腸埃希菌的最低抑菌濃度(MIC)。將經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的腹膜透析管載體置入無菌的24孔板中，隨機分為

2、6組:空白對照組（陰性對照組）、1/2MIC左氧氟沙星組（陽性對照組）、1/2MIC苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組。從開始建立大腸埃希菌生物膜模型時，就將藥物加入藥物干預(yù)組調(diào)成相應(yīng)的藥物濃度。于生物膜早（1天）、中（3天）、晚(7天)期，分別利用細(xì)菌蛋白抽提試劑提取24孔板中細(xì)菌總蛋白，通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測不同時間、不同藥物及濃度下大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)

3、的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　在不同藥物抑菌濃度的干預(yù)下，1/2MIC苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組及1/2MIC左氧氟沙星組與空白對照組相比較，無論在生物膜早（1天）、中（3天）、晚（7天）期，大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)的表達(dá)量均減少(P＜0.05)，且不同濃度苦參堿組之間對ompA蛋白表達(dá)量的影響統(tǒng)計學(xué)無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1/2MIC

4、苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組及1/2MIC左氧氟沙星組在大腸埃希菌生物膜早、中、晚期均能抑制其外膜蛋白A(ompA)的表達(dá)。
　　第二部分大腸埃希茵OmpA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　目的:
　　對大腸埃希菌的外膜蛋白A基因（ompA）進(jìn)行克隆，鑒定，構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，為構(gòu)建OmpA過表達(dá)菌株奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以大腸埃希菌K12菌株基因組DNA為

5、模板，用PCR法擴(kuò)增基因ompA，接著用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等系列方法，將此基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒ompA-pET-32a，并通過PCR進(jìn)行驗證，將初步驗證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。將鑒定正確的重組體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主Ecoli Rosetta菌株內(nèi)，為后續(xù)對轉(zhuǎn)化菌株Rosetta以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)做準(zhǔn)備。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)PCR鑒定、DNA測序驗證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，證實ompA基因正確地插入到p