PGE2-EP2介導間充質(zhì)干細胞向急性肺損傷小鼠肺組織歸巢的效應(yīng)和機制研究.pdf

1、第一部分 高表達EP2的MSC向急性肺損傷小鼠肺組織的歸巢及其肺保護效應(yīng)的研究
　　目的:研究EP2高表達對MSC向損傷肺組織歸巢及其肺保護效應(yīng)的影響。
　　方法:慢病毒介導的EP2轉(zhuǎn)染小鼠MSC，轉(zhuǎn)染MSC分成兩組:①僅轉(zhuǎn)染含報告基因的Lenti-GFP，記為MSC-GFP組;②轉(zhuǎn)染含報告基因的Lenti-GFP以及含目的基因的Lenti-EP2，記為MSC-EP2組。慢病毒轉(zhuǎn)染后，采用熒光顯微鏡觀察評估轉(zhuǎn)染效率以確定最高

2、效MOI值。并利用RT-PCR和Western-blot分別測定轉(zhuǎn)染前后EP2 mRNA及EP2蛋白的表達水平。此外，將C57BL/6小鼠隨機分為Control組(NS+PBS)，ALI組(LPS+PBS)，MSC-GFP組(LPS+MSC-GFP)，MSC-EP2組(LPS+MSC-EP2)，氣道內(nèi)注入LPS構(gòu)建ALI小鼠模型，造模4h后按分組給予不同處理，24h和72h后分別進行下列檢測:(1) MSC-EP2移植后向損傷肺組織歸巢

3、情況:分別使用近紅外離體肺臟成像及肺組織熒光鏡檢評價MSC-EP2細胞在損傷肺組織內(nèi)的靶向歸巢作用;(2) MSC-EP2移植對ALI小鼠肺血管內(nèi)皮的修復作用:計算肺濕重/體重比評價肺水腫程度，伊文思藍漏出實驗評價肺微血管內(nèi)皮通透性;(3) MSC-EP2對ALI小鼠肺病理損傷程度的影響:HE染色行組織病理學檢查并進行肺損傷評分以評價肺損傷嚴重程度;(4) MSC-EP2對肺組織局部炎癥反應(yīng)的影響:ELISA法檢測肺組織勻漿中IL-1β

4、、TNF-α、IL-10的濃度評價肺部炎癥反應(yīng)的強度，從而綜合評價高表達EP2的MSC向ALI小鼠肺損傷組織歸巢和促進肺損傷修復的作用。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了高表達EP2的MSC細胞株:RT-PCR和Western-blot檢測結(jié)果證實，與MSC-GFP相比，含目的基因的Lenti-EP2轉(zhuǎn)染的MSC細胞內(nèi)EP2 mRNA及EP2蛋白的表達水平均明顯增高(P＜0.05），提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建了高表達EP2的MSC細胞株。(

5、2) MSC-EP2能夠更加有效地歸巢至損傷肺組織:近紅外成像及肺組織免疫熒光檢測結(jié)果均顯示，與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組中小鼠肺臟的熒光強度顯著增強（P＜0.05），提示EP2高表達的MSC能夠更加有效地歸巢至肺組織。(3) MSC-EP2可更顯著改善肺水腫程度:肺濕重與體重比值結(jié)果顯示，與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組肺水腫程度明顯減輕（P＜0.05）。(4) MSC-EP2可更有效的改善LPS誘導的肺血管內(nèi)皮通

6、透性的增加:伊文斯藍通透性實驗結(jié)果顯示，與MSC-GFP相比，MSC-EP2組肺組織中伊文斯藍的濃度明顯下降（P＜0.05），提示EP2高表達的MSC能夠進一步降低ALI肺血管通透性。(5) MSC-EP2更能夠改善肺部炎癥反應(yīng):通過ELISA檢測肺部炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)，與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組小鼠肺組織中促炎細胞因子IL-1β和TNF-α的水平明顯下降，而抑炎細胞因子IL-10的水平明顯升高(P＜0.05），提示EP2高

7、表達的MSC能夠進一步改善ALI的肺部炎癥反應(yīng)。(6) MSC-EP2移植對ALI小鼠存活率的影響:與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組急性肺損傷小鼠的存活率無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:EP2高表達的MSC能夠更有效地歸巢至ALI小鼠肺組織，從而提高MSC促進肺血管內(nèi)皮的修復、改善肺血管的通透性、降低肺部炎癥反應(yīng)、減輕LPS引起的肺組織病理損傷的作用，最終增強MSC的肺保護效應(yīng)。該研究為提高MSC對ALI的療效提供

8、了新的方向。
　　第二部分 PGE2/EP2介導MSC向損傷肺組織遷移的分子機制
　　目的:探討PGE2促進高表達EP2受體的MSC向損傷肺組織歸巢的分子機制。
　　方法:實驗分組:①未接受PGE2處理的MSC，記為MSC組;②接受PGE2處理的MSC，記為MSC+PGE2組;③接受PGE2處理的MSC-EP2，記為MSC-EP2+PGE2組。分別做如下檢測:(1) Transwell試驗和劃痕試驗檢測MSC的垂直遷移

9、和水平遷移能力，明確PGE2/EP2在EP2促進MSC遷移中的作用。(2) Western Blot檢測MSCs細胞中FAK和及其下游信號分子ERK1/2的磷酸化表水平，以明確FAK及其下游信號分子ERK1/2是否參與了PGE2/EP2介導的MSC遷移。(3)分別使用FAK抑制劑PF573228和ERK1/2抑制劑PD98059預處理MSC及MSC-EP2，再分別行Transwell試驗和劃痕試驗檢測MSC及MSC-EP2的垂直遷移和水

10、平遷移能力，以闡明FAK途徑及其下游信號分子ERK1/2在EP2高表達促進MSC遷移中的地位。
　　結(jié)果:(1) PGE2/EP2是EP2促進MSC遷移的重要通路:與MSCs對照組，PGE2處理組的MSCs水平和垂直遷移率均顯著增加(P＜0.05)，提示PGE2可促進MSC遷移;與MSC+PGE2組相比，MSC-EP2+PGE2組的細胞水平和垂直遷移明顯增加(P＜0.05)，提示PGE2通過EP2受體促進MSC遷移。(2) PGE

11、2/EP2介導的MSC-EP2遷移與FAK途經(jīng)的活化有關(guān):與對照組MSC相比，MSC+PGE2組中MSCs細胞內(nèi)FAK磷酸化表達水平呈增加趨勢，而MSC+PGE2組相比，MSC-EP2+PGE2組中MSCs細胞內(nèi)FAK磷酸化表達水平亦呈增加趨勢，并且與MSC組相比，MSC-EP2+PGE2組中MSCs細胞中FAK磷酸化表達水平明顯增加(P＜0.05)，提示FAK信號通路參與了PGE2/EP2介導的MSC遷移。(3) FAK途徑下游信號分

12、子ERK1/2參與了PGE2/EP2通路介導的MSC-EP2遷移:與對照組MSCs相比，給予PGE2刺激的MSC細胞中的ERK1/2磷酸化水平明顯較高(P＜0.05);而與MSC組相比，EP2高表達的MSC中ERK1/2磷酸化水平明顯增高(P＜0.05)，提示ERK1/2信號通路參與了PGE2/EP2介導的MSC遷移。(4) FAK抑制劑PF573228能夠抑制PGE2對MSC-EP2遷移的趨化作用:transwell和劃痕試驗結(jié)果顯示

13、，與MSC組相比較，MSC+PF573228組MSCs的垂直和水平遷移均明顯減少(P＜0.05);與MSC-EP2組相比較，MSC-EP2+PF573228組MSC的垂直和水平遷移也明顯減少(P＜0.05)，進一步提示FAK信號通路參與了PGE2/EP2介導的MSC遷移。(5) ERK1/2抑制劑PD98059能夠抑制PGE2誘導的MSC-EP2遷移:transwell和劃痕試驗結(jié)果顯示，與MSC組相比較，MSC+PD98059組MSC

14、s的垂直和水平遷移均明顯減少(P＜0.05);與MSC-EP2組相比較，MSC-EP2+PD98059組MSC的垂直和水平遷移也明顯減少(P＜0.05)，進一步ERK1/2信號通路參與了PGE2/EP2介導的MSC遷移。
　　結(jié)論:(1) PGE2能夠促進MSC-EP2細胞遷移。(2) FAK及其下游的ERK1/2是PGE2/EP2介導MSC遷移的關(guān)鍵信號分子。(3)高表達EP2受體能夠通過增強FAK通信號通路的激活及其下游信號分