骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠肺組織內(nèi)的分化及對肺損傷治療作用的研究.pdf

1、多種原因可損傷肺泡上皮細(xì)胞，造成肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，影響肺的通氣和換氣功能，導(dǎo)致呼吸衰竭，甚至死亡。肺泡上皮細(xì)胞的損傷可見于多種肺部疾病，如肺纖維化、肺氣腫、肺囊腫、急性呼吸窘迫綜合征等?，F(xiàn)行的治療方法主要是盡早去除致病因素，減輕肺組織炎癥，以減輕肺組織損傷以及肺纖維化的形成，但治療效果并不理想。肺移植雖然為終末期肺疾病患者的治療提供了一種手段，但由于其面臨著諸多問題：如供體來源困難，急慢性排斥反應(yīng)的產(chǎn)生，移植后生存率不高，費用昂貴等，使

2、得肺移植難以廣泛開展。如何治療肺損傷及肺纖維化，改善患者的呼吸功能，提高患者的生活質(zhì)量是當(dāng)前國際上的研究熱點。干細(xì)胞由于其自我復(fù)制及多向分化的特點已經(jīng)被廣泛研究用于多種疾病的治療。本研究旨在觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)植入博來霉素(bleomycin，BLM)誘發(fā)的肺損傷大鼠體內(nèi)后在肺組織內(nèi)的分化及對肺損傷的治療作用，為干細(xì)胞治療肺損傷提供實驗依據(jù)。 本研究共分為四部分。 第

3、一部分：大鼠MSCs的體外培養(yǎng)及鑒定3原代培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs(rMSCs)，純化、鑒定。觀察rMSCs用含不同濃度胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)及不同代rMSCs的生長狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的rMSCs大部分呈梭形或紡錘形，細(xì)胞體積大，呈放射狀分布，傳代后生長明顯加快，P15以后生長速度稍有減緩；細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測發(fā)現(xiàn)CD34、CD45陰性，CD44表達(dá)77.3％、CD166表達(dá)94.7％，表明獲得了純度較高的rMSCs；

4、多種FBS比較發(fā)現(xiàn)，含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液更為適合rMSCs的生長；P1、P3、P5及P10細(xì)胞的增殖無明顯差異，表明細(xì)胞早期傳代對rMSCs的增殖無影響。由此我們確定此后的實驗中將選用P3-P10代的細(xì)胞，用含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)以確保MSCs的良好狀態(tài)。 第二部分：大鼠MSCs在大鼠肺組織內(nèi)的分化取培養(yǎng)的rMSCs及大鼠骨髓單個核細(xì)胞，DAPI標(biāo)記后植入受體大鼠體內(nèi)。受體大鼠分為5組：(1

5、)肺損傷組：大鼠氣管內(nèi)注入BLM5mg/kg；(2)MSCs治療組：大鼠氣管內(nèi)注入等量BLM，12h后經(jīng)尾靜脈注入rMSCs，5×106個/只；(3)MSCs對照組：大鼠氣管內(nèi)注入等體積PBS，rMSCs注射同MSCs治療組。(4)單個核細(xì)胞對照組：大鼠氣管內(nèi)注入等量BLM，12h后經(jīng)尾靜脈注入單個核細(xì)胞，5×106個/只；(5)正常對照組。1w、2w及4w后觀察肺組織及植入細(xì)胞的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺損傷組大鼠在rMSCs植入后1w、2w

6、及4w肺泡間隔、基質(zhì)膠原逐漸增多。熒光顯微鏡下可見MSCs治療組大鼠肺組織中有少量植入的細(xì)胞(藍(lán)色胞核，DAPI標(biāo)記)，并且部分植入的細(xì)胞胞漿為紅色(細(xì)胞角蛋白陽性，Cy3標(biāo)記)，在rMSCs植入后2w還發(fā)現(xiàn)細(xì)支氣管壁有少量同時被DAPI和Cy3標(biāo)記的細(xì)胞，其余各組未發(fā)現(xiàn)雙標(biāo)的細(xì)胞，表明rMSCs可在肺損傷大鼠肺組織中存活，并可分化為肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞，在此過程中肺組織的損傷起著重要作用。 第三部分：大鼠MSCs對肺損

7、傷大鼠的治療作用4rMSCs的取材、培養(yǎng)、標(biāo)記及移植同第二部分。受體大鼠分為4組：肺損傷組、MSCs治療組、MSCs對照組及正常對照組，各組處理同第二部分。2w后取肺組織及支氣管肺泡灌洗液(BALF)，作病理學(xué)觀察，檢測肺纖維化的相關(guān)指標(biāo)及肺組織中TGFβ1、PDGF-A、PDGF-B、IGF-ⅠmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rMSCs植入2w后可顯著降低肺損傷大鼠肺組織中增高的肺泡間隔厚度、間質(zhì)面積、Ⅰ、Ⅲ型膠原以及BALF中層粘連蛋白

8、(LN)、透明質(zhì)酸(HA)及肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量。TGFβ1、PDGF-A、PDGF-B、IGF-ⅠmRNA表達(dá)較肺損傷組也有明顯降低。以上結(jié)果表明rMSCs的植入可減少肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞外基質(zhì)的含量，減輕肺損傷及肺纖維化的形成，而此治療結(jié)果可能與rMSCs的植入減少了TGFβ1、PDGF-A、PDGF-B、IGF-Ⅰ等細(xì)胞因子的合成有關(guān)。 第四部分：人MSCs的培養(yǎng)及對肺損傷大鼠的治療作用原代培養(yǎng)人MSCs(hMS

9、Cs)，純化、鑒定，觀察其生長狀況，DAPI標(biāo)記后植入受體大鼠體內(nèi)。受體大鼠分組及處理同第三部分。2w后觀察肺組織及植入細(xì)胞的變化，并檢測肺纖維化的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下可見MSCs治療組大鼠肺組織中有少量植入的細(xì)胞(藍(lán)色胞核，DAPI標(biāo)記)，并且部分植入的細(xì)胞胞漿為紅色(細(xì)胞角蛋白陽性，Cy3標(biāo)記)，其余各組均未發(fā)現(xiàn)雙標(biāo)的細(xì)胞；HE、Masson染色發(fā)現(xiàn)肺損傷組大鼠肺泡間隔、膠原，BALF中LN、HA以及肺組織中HYP含量較

10、正常大鼠均有明顯增加，MSCs治療組大鼠上述各指標(biāo)較肺損傷組有明顯降低，表明將hMSCs在大鼠體內(nèi)異種移植，其可在肺損傷大鼠肺組織內(nèi)存活并分化為肺泡上皮細(xì)胞，對肺損傷、肺纖維化同樣有治療作用。 結(jié)論：(1)含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液更適合rMSCs的培養(yǎng)，使rMSCs保持良好的增殖狀態(tài)；(2)rMSCs可在肺損傷大鼠肺組織中存活并分化為肺泡上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞，并可有效減輕肺損傷及肺纖維化，這種治療效果可能與rM