巨細(xì)胞病毒潛伏感染-再激活在潰瘍性結(jié)腸炎患者病程中的作用機(jī)制的初步探究.pdf

1、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于人群普遍易感的病原體之一，免疫力低下的患者，CMV感染或再激活可增加患者死亡率。因此長期以來其廣受微生物學(xué)和感染領(lǐng)域?qū)＜谊P(guān)注。
　　近幾年來，消化科臨床醫(yī)生對這個(gè)跨學(xué)科領(lǐng)域也高度重視，因研究顯示CMV感染與潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)疾病復(fù)發(fā)和治療激素抵抗有關(guān)。而UC在我國發(fā)病呈上升的趨勢，且中-重度UC患者常需要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素（簡稱激素）治療，

2、這為患者體內(nèi)CMV感染或再激活提供了有利條件。臨床研究提示:UC患者激素治療過程中感染CMV會(huì)導(dǎo)致激素療效下降或無效，患者病情加重[1]，抗CMV治療后患者激素抵抗可逆轉(zhuǎn)。但目前CMV對UC病程的影響，治療時(shí)機(jī)的選擇等方面存在很多的臨床問題，鑒于這個(gè)臨床問題，本研究通過科學(xué)研究期望提供臨床思路。因此本研究的目的是:1）建立CMV潛伏期及再激活的細(xì)胞模型;2）探究CMV潛伏期及再激活模型激素抵抗的發(fā)生機(jī)制及CMV對UC炎癥的影響，CMV滅

3、活后對激素抵抗和細(xì)胞因子的影響;3）研究CMV潛伏期及再激活模型以及感染滅活病毒的模擬潛伏和模擬再激活組、UC患者感染CMV及抗病毒治療后，細(xì)胞模型和UC合并CMV感染的患者全血細(xì)胞miRNA基因的改變及相關(guān)的信號通路。
　　研究分為三部分:
　　第一部分 巨細(xì)胞病毒潛伏期-再激活細(xì)胞模型的建立
　　方法:1）模型建立初步階段:應(yīng)用MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)CMV病毒;應(yīng)用PMA誘導(dǎo)分化THP-1為巨噬細(xì)胞;2）潛伏期細(xì)胞模型

4、:CMV感染未分化的單核細(xì)胞不同時(shí)間;3）再激活模型的建立:比較兩個(gè)模型:感染潛伏期CMV的單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞模型，與CMV感染分化的巨噬細(xì)胞，這兩種再激活模型。采用觀察細(xì)胞形態(tài)、qRT-PCR檢測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)病毒載量以及RT-PCR檢測病毒早期、晚期相關(guān)基因的表達(dá)來驗(yàn)證模型的建立。最終選擇了CMV感染分化的巨噬細(xì)胞模型。
　　結(jié)果:1）CMV感染THP-1源性單核細(xì)胞系形態(tài)學(xué):懸浮生長狀態(tài);2）CMV病毒載量在感染3天后穩(wěn)定，

5、病毒即刻早期基因72(immediate early72，IE72)不表達(dá)，病毒晚期相關(guān)基因UL82表達(dá)，表明病毒感染THP-1后進(jìn)入潛伏期;3）將感染潛伏期CMV的單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞貼壁，但病毒載量不增加，IE72也不表達(dá);4）將CMV感染分化的巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)病毒載量升高，在感染第3天時(shí)，IE72表達(dá)量升高最顯著。
　　第二部分 CMV感染導(dǎo)致UC患者激素抵抗的機(jī)制及對炎癥的影響
　　方法:1）細(xì)胞分組:在

6、已建立的潛伏期和再激活細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，將THP-1細(xì)胞系分為4組:(Ⅰ)對照組;(Ⅱ)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞組（簡稱PMA組）;(Ⅲ)CMV潛伏期細(xì)胞模型（簡稱CMV組）;(Ⅳ)CMV再激活細(xì)胞模型（簡稱PMA+CMV組）。
　　2)采用qRT-PCR方法檢測4組細(xì)胞中GRβ、GRα及兩者比值的變化，WesternBlot方法檢測GRβ、GRα及磷酸化的GRα蛋白水平變化，多因子ELISA方法檢測各組細(xì)胞上清液促炎因子和抑炎因

7、子的變化。
　　3)紫外線滅活CMV病毒，檢測病毒滅活后對激素受體和細(xì)胞因子水平變化。
　　結(jié)果:1）CMV潛伏感染時(shí)GRβ、GRαmRNA和蛋白輕度升高，但GRβ/α無顯著改變;2）CMV再激活時(shí)GRβ、GRα顯著升高，GRβ/α升高(P＜0.05)，且無功能的Ser226位磷酸化的GRα也升高，與激素抵抗相關(guān);3）與對照組相比，CMV潛伏期感染IL-10輕度升高（0.72±0.12 pg/ml vs0.87±0.21pg

8、/ml，P=0.036），抗炎因子IL-5輕度下降(MFI:48.7±3.2 vs43.6±2.6，P=0.02)，其他炎性細(xì)胞因子無顯著變化;4）再激活模型中促炎因子IL-6(1.22±0.02pg/ml vs4877.13±31.51 pg/ml，P＜0.001)、TNF-α(1.35±0.15pg/ml vs1479.88±29.8pg/ml，P＜0.001)顯著升高，抗炎因子IL-5下降(MFI:48.7±3.2 vs35.6±

9、3.7，P=0.016)，與UC炎癥加重有關(guān);CMV潛伏期及再激活，IL-10均升高;5）感染滅活病毒的模擬潛伏期和PMA+滅活CMV的模擬再激活模型，其激素受體和包括IL-10在內(nèi)的各種細(xì)胞因子與對照相比均無變化。
　　第三部分 細(xì)胞模型和UC患者標(biāo)本差異miRNA表達(dá)譜的變化
　　方法:1）細(xì)胞模型分組:(Ⅰ) CMV潛伏感染模型;(Ⅱ)CMV再激活細(xì)胞模型;(Ⅲ)感染滅活病毒的潛伏期細(xì)胞模型;(Ⅳ)感染滅活病毒的再激活

10、細(xì)胞模型;2）UC患者分組:選取3例合并CMV感染的激素抵抗UC患者抗CMV治療前后的全血細(xì)胞。Trizol法提取各組細(xì)胞RNA，檢測RNA的完整度和純度，采用miRNA表達(dá)譜芯片檢測細(xì)胞模型及患者標(biāo)本中miRNA表達(dá)譜的變化，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶基因，并進(jìn)行基因富集分析。
　　結(jié)果:1）獲得miRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)譜;2）細(xì)胞模型分組中，潛伏期與再激活組有536個(gè)顯著差異的基因;模擬潛伏期感染與模擬再激活感染模型有509種基因差異

11、表達(dá);再激活感染模型與模擬再激活感染模型有96種基因改變。生物信息學(xué)分析顯示差異表達(dá)的基因主要與炎癥、細(xì)胞粘附、分化、細(xì)胞核蛋白相關(guān)基因有關(guān);3) UC患者miRNA表達(dá)譜顯示，抗病毒治療前后相比，hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-4419b和hsa-miR-642a-3p升高，這些miRNA與PMA誘導(dǎo)蛋白、DNA結(jié)合蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體、轉(zhuǎn)化生長因子相關(guān);4）細(xì)胞模型中CMV激活期、潛伏期及滅活病毒感染的差異表達(dá)的mi

12、RNA，與UC患者CMV感染治療前后比較，hsa-miR-4419b均升高，研究hsa-miR-4419b的功能可能有助于揭示CMV感染UC患者病情和激素抵抗的機(jī)制。
　　結(jié)論:1.成功建立模擬CMV潛伏感染和再激活細(xì)胞模型;
　　2.CMV再激活感染時(shí)GRβ絕對或相對升高，以及GRα磷酸化無功能，可能是患者激素抵抗的機(jī)制之一;
　　3.CMV再激活感染使促炎因子（IL-10等）增加和抑炎因子(IL-5)下降，其失衡可