海洋細(xì)菌Glaciecola mesophila KMM241產(chǎn)木聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用潛力研究.pdf

1、海洋總面積占到地球面積70％以上，海水占到地球總水量的97％，因此海洋環(huán)境是地球生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，海洋碳循環(huán)在地球生物圈碳循環(huán)中起到至關(guān)重要的作用。在海洋碳循環(huán)過(guò)程中，海洋微生物扮演著重要的角色，它們將海洋浮游植物和光合細(xì)菌通過(guò)光合作用儲(chǔ)存的有機(jī)碳重新分解，以二氧化碳的形式重新釋放到大氣圈中。木聚糖是一種最主要的半纖維素，是地球上僅次于纖維素的第二大碳源物質(zhì)，也是海洋環(huán)境中有機(jī)碳的重要組成部分。與纖維素相比，木聚糖結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，木

2、聚糖的完全降解需要多種酶類的協(xié)同作用。β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)能夠水解木聚糖主鏈的β-1，4-木糖苷鍵，在木聚糖的降解中起到關(guān)鍵作用，因此在整個(gè)海洋碳循環(huán)中也具有重要意義。海洋環(huán)境普遍具有高鹽，高流動(dòng)性的特點(diǎn)，而深海區(qū)域（深度超過(guò)2000米）更是具有高壓，低溫，黑暗，寡營(yíng)養(yǎng)等極端特征。海洋中的微生物為了適應(yīng)海洋環(huán)境，進(jìn)化出了許多與之相適應(yīng)的特點(diǎn)，并且在其基因組中往往蘊(yùn)含著許多有價(jià)值的基因資源。因此海洋不但是物種多樣

3、性的寶庫(kù)，也是基因的寶庫(kù)。對(duì)這些基因資源的序列分析和功能鑒定對(duì)于研究海洋生境中的許多生化過(guò)程具有重要理論意義。
　　 Glaciecola mesophila KMM 241是一株分離自海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的海洋細(xì)菌。我們的前期研究表明，該菌株能夠產(chǎn)生多種木聚糖酶，并且在前期研究中我們已經(jīng)對(duì)該菌株產(chǎn)生的一個(gè)屬于糖苷水解酶第十家族的木聚糖酶XynA進(jìn)行了基因克隆和性質(zhì)研究。在此基礎(chǔ)上，本論文對(duì)該菌株所產(chǎn)的另一個(gè)木聚糖酶XynB進(jìn)行了基因

4、序列、分子結(jié)構(gòu)、生化性質(zhì)及其N端結(jié)構(gòu)域的功能研究，并探討了木聚糖酶XynA在提高面包品質(zhì)中的應(yīng)用潛力，取得了以下主要結(jié)果。
　　 1.木聚糖酶XynB的基因克隆和序列分析
　　 由于菌株G.mesophila KMM241與另一株基因組序列已經(jīng)公布的海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas atlantica T6c的16S rDNA序列相似性為99％。根據(jù)菌株P(guān)seudoalteromonas atlantica T

5、6c基因組中木聚糖酶基因(Gene ID:4172855)的序列設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物，以菌株G mesophila KMM 241基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到了木聚糖酶基因xynB的全序列。序列分析表明，xynB基因序列全長(zhǎng)2739 bp，編碼的木聚糖酶XynB的前體含912個(gè)氨基酸殘基。木聚糖酶XynB的前體由N端的信號(hào)肽序列(Metl-Ala43)，一個(gè)功能未知的N端結(jié)構(gòu)域(NTD，Glu44-Arg584)和一個(gè)C端的糖苷水

6、解酶第八家族(GH8)催化結(jié)構(gòu)域(CD，Ser585-Glu912)組成。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)只有三個(gè)酶與XynB氨基酸全序列具有同源性，分別是來(lái)自菌株P(guān).atlantica T6c(98％)、Glaciecola chathamensisS 18K6(80％)和Glaciecolapolaris LMG 21857(73％)的糖苷水解酶，但這三個(gè)酶都是從基因組序列中推定的糖苷水解酶，并沒(méi)有被研究報(bào)道。序列比對(duì)結(jié)果表明，XynB的催化結(jié)構(gòu)域

7、與其它酶的最高相似性只有41％，在已經(jīng)報(bào)道的第八家族木聚糖酶中，與之相似性最高的是來(lái)自環(huán)境DNA文庫(kù)的Xyn8（39％，ABB71891）。將XynB的催化結(jié)構(gòu)域與已報(bào)道的其它4個(gè)第八家族木聚糖酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)在第八家族木聚糖酶中高度保守的氨基酸殘基，分別為第586位的谷氨酸，第646位和第786位的天冬氨酸，這三個(gè)殘基被認(rèn)為在第八家族糖苷水解酶的催化反應(yīng)中起到重要作用。序列分析表明，XynB的NTD的氨基酸序列與數(shù)

8、據(jù)庫(kù)中已知功能的序列均沒(méi)有明顯的同源性，表明該NTD可能是一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的結(jié)構(gòu)域。因此，對(duì)XynB的序列分析表明，該酶是GH8家族中一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的多結(jié)構(gòu)域木聚糖酶。
　　 2.木聚糖酶XynB的異源表達(dá)和性質(zhì)研究
　　 XynB是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域木聚糖酶，通過(guò)異源表達(dá)得到有活性的酶對(duì)酶的催化性質(zhì)研究非常重要。我們通過(guò)pET-22b原核表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET-22b-xynB，并且在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了

9、可溶性表達(dá)。為了獲得較高的表達(dá)量和表達(dá)活性，我們進(jìn)行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了最佳表達(dá)條件為在0.5 mM的IPTG誘導(dǎo)下15℃培養(yǎng)96 h，在此條件下重組大腸桿菌的胞內(nèi)酶活最高可達(dá)到4.2 U/ml菌液。由于電泳分析表明在最適條件下培養(yǎng)48 h，胞內(nèi)酶蛋白的表達(dá)量基本已達(dá)到最大，并且此時(shí)目的蛋白占細(xì)胞總蛋白的比例較高，我們選擇在最適條件下培養(yǎng)48 h后從胞內(nèi)分離純化重組木聚糖酶XynB，這不但利于重組酶的純化，而且縮短了培養(yǎng)時(shí)間。通過(guò)

10、細(xì)胞超聲破碎獲得胞內(nèi)可溶蛋白成分，再通過(guò)陰離子交換色譜層析和鎳柱親和層析兩步純化，得到了電泳純的重組XynB，SDS-PAGE顯示分子量約為100 kDa。根據(jù)氨基酸序列計(jì)算表明，XynB去掉信號(hào)肽之后的分子量為97.1 kDa。因此，重組表達(dá)的XynB是一個(gè)含有NTD和CD的多結(jié)構(gòu)域木聚糖酶。
　　 對(duì)重組XynB的底物特異性研究結(jié)果表明，該酶是一個(gè)特異性的內(nèi)切木聚糖酶，能高效水解山毛櫸木聚糖和燕麥木聚糖，對(duì)羧甲基纖維素、淀粉

11、、海藻多糖、幾丁質(zhì)以及甘露聚糖均沒(méi)有活性。XynB的最適酶活pH為6.0-7.0，在酸性條件下酶活喪失較快，在弱堿性條件下仍能保持較高的酶活，是一個(gè)中性略偏堿性的木聚糖酶。該酶在中性偏堿性較廣的pH范圍(pH6.0-pH10.0)內(nèi)比較穩(wěn)定，在15℃放1h后還能保持80％以上的殘余酶活。XynB的最適酶活溫度為35-40℃，在0℃和5℃時(shí)分別保持有最高酶活的7.5％和14.6％，該酶的熱穩(wěn)定性很差，在35℃保溫1h后只保持不到40％的殘

12、余酶活，在45℃保溫20 min便喪失全部酶活。這些結(jié)果說(shuō)明該酶具有一定的適冷特征。 Co2+、SDS、EDTA、Zn2+、Ni2+、Mn2+和Li2+在5 mM濃度下能夠強(qiáng)烈抑制XynB酶活性，但在1 mM濃度下只有Co2+的抑制作用明顯。由于Fe3+和Cu2+兩種重金屬離子在1 mM濃度下對(duì)酶活幾乎沒(méi)有抑制作用，這可能使該酶在某些工業(yè)應(yīng)用中具有優(yōu)勢(shì)。NaCl對(duì)XynB的活性并沒(méi)有促進(jìn)作用，在低濃度NaCl存在時(shí)（0.5 M及以下），

13、XynB的酶活性受到輕微抑制作用（殘余酶活在85％以上）;當(dāng)NaCl濃度從1.0M增加到接近飽和的4.0M時(shí)，該酶的殘余酶活僅從67％下降到約40％，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的NaCl耐受性，這反映了該酶對(duì)海洋高鹽環(huán)境的適應(yīng)。XynB對(duì)山毛櫸木聚糖和燕麥木聚糖的Km值分別為5.82 mg/ml和11.86 mg/ml，kcat/Km值分別為104.64ml/mg.s和60.03 ml/mg.s，表明XynB對(duì)山毛櫸木聚糖具有更高的親和力和催化效率。

14、XynB不能水解木三糖和木四糖，能夠高效水解木六糖生成木四糖、木三糖和木二糖，該酶水解木五糖的效率比水解木六糖時(shí)低很多，只能產(chǎn)生非常少量的木三糖和木二糖，另外所有的酶解反應(yīng)中均沒(méi)有木糖產(chǎn)生，這表明XynB是一個(gè)嚴(yán)格的內(nèi)切木聚糖酶，需要至少5個(gè)糖基單元才能進(jìn)行有效的水解。
　　 木聚糖酶在制漿造紙、食品、飼料、紡織等行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用，特別是制漿造紙工業(yè)是應(yīng)用木聚糖酶最多的行業(yè)。XynB具有對(duì)熱敏感的特征，在一些不能進(jìn)行高溫加熱的

15、食品加工領(lǐng)域中可能具有應(yīng)用價(jià)值。另外，XynB具有耐鹽的特征，在海產(chǎn)品和其他含鹽產(chǎn)品的加工中也可能具有應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.NTD的異源表達(dá)以及NTD對(duì)不可溶多糖的結(jié)合功能研究
　　 為了研究NTD在XynB催化木聚糖降解中的作用，我們對(duì)NTD進(jìn)行了單獨(dú)異源表達(dá)。通過(guò)pET-22b原核表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了NTD的表達(dá)質(zhì)粒，并且在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了NTD的可溶性表達(dá)。為了獲得有活性的目的蛋白，對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行

16、了優(yōu)化，最終選擇的表達(dá)條件為:在15℃條件下用0.5 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20 h。然后通過(guò)超聲波細(xì)胞破碎獲得胞內(nèi)可溶性蛋白，利用鎳柱親和層析法純化得到電泳純的重組NTD。為了驗(yàn)證NTD在XynB催化木聚糖降解中是否具有結(jié)合底物的功能，我們首先利用SDS-PAGE檢測(cè)了NTD是否能結(jié)合不可溶木聚糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NTD對(duì)不可溶木聚糖具有明顯的吸附結(jié)合能力。此外，NTD對(duì)也具有微晶纖維素很強(qiáng)的吸附結(jié)合能力，這些結(jié)果表明，NTD中可能含有

17、多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)。由于NTD的氨基酸序列與已報(bào)道的CBM沒(méi)有同源性，所以NTD中含有的CBM可能是新型的CBM。
　　 4.NTD的蛋白結(jié)晶
　　 由于NTD的氨基酸序列與目前數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能的蛋白序列都沒(méi)有明顯的同源性，因此難以通過(guò)同源比對(duì)推測(cè)NTD中CBM的結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步揭示NTD的結(jié)構(gòu)與功能，我們決定通過(guò)結(jié)晶來(lái)解析NTD的結(jié)構(gòu)，然后分析其中可能含有的新型CBM的結(jié)構(gòu)。由于蛋白結(jié)晶需要大量高純度的蛋白，我們

18、首先對(duì)NTD進(jìn)行了大批量高純度制備。經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析，Q柱（強(qiáng)陰離子交換柱）層析和凝膠過(guò)濾層析3步純化，得到高純度的重組NTD蛋白樣品。將樣品濃縮到8 mg/ml濃度，經(jīng)過(guò)坐滴氣相擴(kuò)散法初篩，確定出了有利于NTD晶體生長(zhǎng)的條件，獲得一些雪花狀的小晶體。由于這些晶體太小，分辨率太低，我們又利用懸滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行了復(fù)篩，經(jīng)過(guò)結(jié)晶條件的優(yōu)化，得到了晶體生長(zhǎng)的最佳條件為pH9.0的0.1M Tris-HCl緩沖體系，添加30％(w/v)的PEG

19、6000。在此條件下目前已長(zhǎng)出棒狀晶體，該晶體經(jīng)SDS-PAGE分析已證實(shí)為蛋白結(jié)晶。這些晶體還在進(jìn)一步生長(zhǎng)之中，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的生長(zhǎng)之后，即可通過(guò)X射線衍射分析其分辨率。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步得到NTD晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)而闡明其多糖結(jié)合作用機(jī)制以及NTD與CD的協(xié)同作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.木聚糖酶XynA提高面包品質(zhì)的應(yīng)用潛力研究
　　 我們的前期研究表明，Glaciecola mesophila KMM 241分泌的木聚糖

20、酶XynA是一個(gè)GH10家族的適冷木聚糖酶。本論文研究了木聚糖酶XynA提高面包品質(zhì)的潛力，并與GH10家族的中溫木聚糖酶EX1進(jìn)行了比較。最適添加量的分析表明，EX1的最適添加量為270 U/kg，而Xyn A的最適添加量為0.9 U/kg。添加X(jué)yn A和EX1都會(huì)使面粉的弱化度降低，在最適添加量下可使弱化度降低50％，但是在降低面團(tuán)形成時(shí)間方面，Xyn A的作用較EX1更顯著。在面包體積的影響來(lái)看，兩種木聚糖酶的作用都很顯著。這兩