小麥木聚糖酶抑制蛋白的性質(zhì)及對(duì)外源木聚糖酶功效的影響研究.pdf

1、β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶可解除大麥、小麥和麥麩等谷物原料中木聚糖的不利影響。然而，由于小麥中木聚糖酶抑制蛋白的含量較高，對(duì)小麥加工中外加木聚糖酶的活力產(chǎn)生了較強(qiáng)的抑制作用，從而導(dǎo)致木聚糖酶并不能完全發(fā)揮其應(yīng)有的作用。本課題研究了小麥中抑制蛋白對(duì)抗性酶和敏感酶的不同作用，詳細(xì)結(jié)果如下:
　　(1)小麥籽粒中抑制蛋白的純化及抑制性質(zhì)。在不同谷物中，小麥、黑麥、蕎麥和綠麥中具有較高的木聚糖酶抑制活性，在燕麥與大麥中較低，水稻、玉米和高粱

2、中沒有檢測(cè)到木聚糖酶抑制活性。從小麥品種小偃22中分離純化到一種木聚糖酶抑制蛋白，該蛋白的分子量為29kDa，與其他木聚糖酶抑制蛋白N端序列無同源性，但與大麥幾丁質(zhì)酶的N端序列高度同源，卻無幾丁質(zhì)酶活性;該抑制蛋白對(duì)黑曲霉GH11木聚糖酶抑制作用較強(qiáng)，但對(duì)真菌GH10木聚糖酶沒有抑制作用，綜合上述性質(zhì)推測(cè)該抑制蛋白可能是一新型的XIP型木聚糖酶抑制蛋白。純化的抑制蛋白對(duì)GH11家族木聚糖酶抑制作用的最適溫度為30℃，最佳抑制時(shí)間為40m

3、in;該抑制蛋白的半失活溫度為74℃，熱穩(wěn)定性較好。
　　(2)小麥抑制蛋白基因的克隆、表達(dá)及抑制性質(zhì)。利用RT-PCR的方法從鄭麥9023和鄭麥366兩個(gè)小麥品種幼胚中分別克隆了xip-9023和xip-366兩個(gè)XIP型抑制蛋白的基因，結(jié)果顯示XIP-9023與模板蛋白XIP-Ⅰ氨基酸序列完全一致，XIP-366與模板蛋白有1個(gè)氨基酸差異，表明不同小麥品種中XIP基因具有微小的差異。XIP-9023蛋白對(duì)木聚糖酶的最適抑制pH

4、和最適抑制溫度分別為pH7和40℃。XIP-9023蛋白與木聚糖酶在反應(yīng)40min時(shí)抑制作用達(dá)到峰值。當(dāng)木聚糖酶活力被抑制50％時(shí)，抑制蛋白與酶的摩爾比為26∶1。本實(shí)驗(yàn)采用的真菌木聚糖酶均可被XIP-9023抑制，同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)來自牛瘤胃的一株細(xì)菌Paenibacillus spp.所產(chǎn)木聚糖酶也能被XIP-9023強(qiáng)烈抑制。
　　(3)抗性木聚糖酶突變體構(gòu)建及篩選。通過分析XIP與構(gòu)巢曲霉GH10木聚糖酶相互作用的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)

5、了黑曲霉GH10木聚糖酶的30個(gè)單點(diǎn)突變體;根據(jù)細(xì)菌及植物GH10木聚糖酶中與底物結(jié)合比較重要的短肽結(jié)構(gòu)，將其序列整體置換到黑曲霉GH10木聚糖酶的相應(yīng)位置中，最終獲得了22個(gè)突變體;但多數(shù)木聚糖酶突變體活力大幅度降低，甚至完全喪失。由于XIP抑制蛋白屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠與底物競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合木聚糖酶中相同的位點(diǎn)，因此通過底物結(jié)合位點(diǎn)突變獲得抑制蛋白抗性木聚糖酶，使其能夠與底物結(jié)合，但對(duì)抑制蛋白失去結(jié)合能力，可能并不是一條可行的突變策略。

6、
　　(4)抑制蛋白的抗性木聚糖酶的篩選及性質(zhì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存木聚糖酶產(chǎn)生菌以及商品化的木聚糖酶進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)真菌的木聚糖酶粗酶液均能被XIP-9023所抑制，抑制率從24％到70％不等，這與已知的研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)首次研究并發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的木聚糖酶受到XIP-9023的嚴(yán)重抑制，并發(fā)現(xiàn)新麗鞭毛菌的木聚糖酶對(duì)XIP-9023抑制蛋白具有明顯的抗性，抑制率為6％。等摩爾比例下反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)新麗鞭毛菌的木聚糖酶純酶對(duì)XIP-902

7、3具有強(qiáng)烈的抗性?？剐悦傅馁|(zhì)譜分析結(jié)果與UniProt數(shù)據(jù)庫中Q9UV68、Q01426、Q69IG9木聚糖酶序列匹配，其中以Q69IG9木聚糖酶基因?yàn)槟０搴铣傻哪揪厶敲竂YN3具有酶活力，不同摩爾比例下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，XIP-9023抑制蛋白對(duì)該重組抗性木聚糖酶XYN3沒有抑制作用，因此確定木聚糖酶XYN3為抗性木聚糖酶。該抗性酶最適反應(yīng)條件分別為pH5.4和60℃;抗性木聚糖酶XYN3在pH3.6時(shí)具有最大酶活力的72％，40℃下保溫3

8、0min后抗性酶依然殘留80％以上的酶活力，因此該酶具有較好的酸適應(yīng)性和熱穩(wěn)定性。將重組抗性木聚糖酶XYN3與A.niger的敏感木聚糖酶（UniProt登錄號(hào)P55328）和Penicillium funiculosum敏感木聚糖酶(UniProt登錄號(hào)Q9HFH0)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)抗性木聚糖酶的“拇指”部位氨基酸發(fā)生了GTS到GGSE的突變。
　　(5)抗性木聚糖酶XYN3對(duì)不同比例小麥玉米混合料的酶解作用。在小麥比例為20

9、％～60％時(shí)，抗性酶XYN3在42℃或39℃下的還原糖產(chǎn)量始終高于敏感酶的還原糖產(chǎn)量，表明抗性酶比敏感酶降解小麥木聚糖更為有效。小麥比例為20％時(shí)添加抗性酶產(chǎn)生總糖為3.239g/L，相比敏感酶提高了8.36％，尤其是木二糖含量增加了45％。小麥比例為40％時(shí)，抗性酶比敏感酶的降解產(chǎn)物木寡糖和木糖總量增加了6.5％，其中木二糖含量增加了89％。酶解反應(yīng)系統(tǒng)中添加豬消化液時(shí)，抗性酶在39℃下催化小麥產(chǎn)生的還原糖量最大值比敏感酶提高23％。