15250.海洋來源產(chǎn)木聚糖酶的鏈霉菌菌種篩選與代謝工程改造

1、碩士學(xué)位論文海洋來源產(chǎn)木聚糖酶的鏈霉菌菌種篩選與代謝工程改造ScreeningandMetabolicEngineeringofMarinederivedStreptomycesStrainswithImprovedXylanaseProduction學(xué)號(hào)：21018011完成日期：窒Q!呈生墨旦壘旦大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要玉米秸稈、小麥秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物是來源豐富的

2、可再生生物質(zhì)資源，利用其進(jìn)行可再生清潔能源和生物基化學(xué)品的生產(chǎn)日益引起人們的關(guān)注。農(nóng)用廢棄物的主要成分是纖維素和半纖維素，其中半纖維素占地球可再生有機(jī)碳源的三分之一，而木聚糖是半纖維素的主要成分。木聚糖的降解不僅能夠被微生物利用轉(zhuǎn)化，而且有助于纖維素與木質(zhì)素的分離，在生物燃料生產(chǎn)和紙漿漂白等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。木聚糖酶降解木聚糖以其環(huán)境友好和高效性成為木聚糖的主要降解方式。放線菌和絲狀真菌是木聚糖酶的主要生產(chǎn)菌，但是野生型菌株中木聚糖酶的

3、產(chǎn)量通常很低。因此如何提高木聚糖酶的生產(chǎn)水平，成為微生物育種中的關(guān)鍵問題。本文首先從大連黃海海域的小平島海泥樣品中分離獲得了八株木聚糖酶活性較好的海洋放線菌菌株，其中菌株M8和M11具有較高的木聚糖酶活性。16SrRNA分析結(jié)果表明，菌株M8的16SrRNA序列與蝕木鏈霉菌(Streptomycesxylophagus)的序列相似性達(dá)到100％；M11的16SrRNA序列與綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Sviridochromogenes)的序列相似

4、性達(dá)到99％。考察不同pH條件下菌株的生長發(fā)現(xiàn)，M1l是一株嗜堿鏈霉菌，在pH110的高堿環(huán)境中生長良好；而菌株M8具有較好的NaCl耐受性。兩株菌株均具有較高的木聚糖酶活性，培養(yǎng)7天后酶活性分別達(dá)到876U／mL和699U／mL。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明，M8木聚糖酶的最適溫度為60℃，最適pH為60；M1l木聚糖酶的最適溫度為70℃，最適pn為60。其中，M11木聚糖酶在60℃或pH5090等極端環(huán)境中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，且無纖維素酶活性，

5、證明該木聚糖酶有望在紙漿漂白工藝中進(jìn)行應(yīng)用。其次，利用核糖體工程和人工鋅指蛋白技術(shù)在細(xì)胞全局水平上對(duì)海洋鏈霉菌的木聚糖酶合成水平進(jìn)行調(diào)控。本文從370株鏈霉素抗性菌株中篩選獲得了27株透明圈較大的突變體。進(jìn)一步的液體酶活測試結(jié)果表明，突變菌株M111(10)的木聚糖酶產(chǎn)量與野生型相比提高了14％。對(duì)其核糖體S12蛋白基因(rpsL)進(jìn)行擴(kuò)增和測序，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)突變位點(diǎn)K88R。該位點(diǎn)位于$12蛋白的核心催化區(qū)域中，與70S核糖體復(fù)合物的

6、穩(wěn)定性及翻譯效率緊密相關(guān)，推測該位點(diǎn)可能是突變株酶蛋白合成水平提高的原因。在酵母菌鋅指蛋白文庫基礎(chǔ)上構(gòu)建了以鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA結(jié)合域，Gal4為激活功能域的放線菌人工鋅指蛋白文庫。篩選獲得了高產(chǎn)木聚糖酶的突變體M8B32，其木聚糖酶產(chǎn)量與野生型相比提高了17％。對(duì)鋅指蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，整合至菌株M8一B32基因組中的鋅指蛋白基因來源于人類基因組，推測該鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠與木聚糖酶合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子上游區(qū)域結(jié)合，調(diào)控木聚