靶向FaBI的抗菌藥物篩選模型的初步研究.pdf

1、摘要 上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要烯脂酰．A C P 還原酶( F a b I ) 是大部分細菌脂肪酸合成所必需的酶，是一種N A D H 依賴型單功能酶，而真核細胞中沒有此酶，它已逐漸成為抗菌藥物研究的熱點靶位。本文利用反義R N A 技術(shù)，構(gòu)建了能夠有效抑制F a b I 表達的工程菌( E ．c o l i ／p H N F ) 。利用上述的工程菌，構(gòu)建了F a b I 靶點超敏全細胞抗菌藥物篩選模型。考察了誘導(dǎo)條件對其反義沉默效

2、果的影響，并以三氯生和氨芐西林分別作為陽性及陰性對照，通過酶標(biāo)儀檢測，初步確定了F a b I 靶點特異性全細胞篩選模型的條件是：誘導(dǎo)劑I P T G 濃度為3 7 ．5 9 m o l ／L 、陽性對照三氯生濃度為2 5 、3 7 ．5 、5 0 9 9 ／m L ，陰性對照氨芐西林濃度為0 ．5 、2 ．5 、5 r t g ／m L ，培養(yǎng)時間為1 6 小時。將此模型用于植物內(nèi)生真菌發(fā)酵樣品的初篩，共篩選樣品5 8 4 7 個，其

3、中陽性樣品為5 5 9 個，陽性率為9 ．7 ％。選擇其中活性較高的H C C B 0 6 3 1 4 菌株進行進一步研究，通過觀察菌株的宏觀和顯微形態(tài)、培養(yǎng)特征以及分析I T S 序列P C R結(jié)果，對H C C B 0 6 3 1 4 進行分類鑒定，確定該菌株屬于鐮孢菌屬( F u s a r i u m s p ) 。對菌株H C C B 6 3 1 4 的代謝產(chǎn)物進行研究，通過硅膠層析和H P L C 方法分離純化得到2 個次級

4、代謝產(chǎn)物，利用質(zhì)譜和核磁共振波譜對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，確定H C C B 0 6 3 1 4 ．1 為恩鐮孢菌素I ( E n n i a t i nI ) ，H C C B 0 6 3 1 4 ．2 為恩鐮孢菌素H 。采用U P L C - M S 對樣品6 3 1 4 ．1 0 進行分析，該樣品存在7 個恩鐮孢菌素類( e n n i a t i n s )化合物，其中分子式為C 3 7 H 6 5 N 3 0 9 的化合物，通過s c

5、 i n f i n d e r 檢索，未能查到相關(guān)e n n i a t i n 類似物，可能為一個新的e n n i a t i n 類似物。關(guān)鍵詞：F a b I ，反義R N A ，模型構(gòu)建，活性篩選，鐮孢菌屬，分離純化J ：海師范大學(xué)碩十學(xué)位論文目錄第一章緒論?????????????????????????????????．1l 反義技術(shù)在新型抗菌藥物研發(fā)中的應(yīng)用??????????????????．．11 ．1 原核生物中

6、常用的反義技術(shù)?????????????????????21 ．2 反義技術(shù)在抗菌藥物新靶點發(fā)現(xiàn)和驗證中的應(yīng)用????????????31 ．3 反義技術(shù)在建立抗菌藥物新篩選模型中的應(yīng)用?????????????52 F a b I 作為抗菌靶點的優(yōu)越性????????????????????????72 ．1 F a b I 的催化機制和生化特性?????????????????????．72 ．2 已發(fā)現(xiàn)的F a b I 抑制劑及其

7、作用機制?????????????????。83 植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的概述?????????????????????93 ．1 植物內(nèi)生真菌的概念及種類?????????????????????93 ．2 ．植物內(nèi)生真菌的研究進展??????????????????????1 03 ．3 植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性??????????????????。1 13 ．3 ．1 植物生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)???????????????????

8、??．1 13 ．3 ．2 殺蟲物質(zhì)??????????????????????????．1 l3 ．3 ．3 抑菌物質(zhì)??????????????????????????．1 23 ．3 ．4 抗腫瘤類物質(zhì)????????????????????????。1 23 ．3 ．5 抗病毒類物質(zhì)????????????????????????．1 33 ．3 ．6 其他類型的代謝產(chǎn)物?????????????????????．1 44 立題

9、依據(jù)???????????????????????????????1 4第二章F a b I 抑制劑篩選模型的建立及活性篩選?????????????????。1 6l 實驗材料???????????????????????????????1 61 ．1 主要試劑和酶??????????????????????????。1 61 ．2 質(zhì)粒和菌種????????????????????????????1 71 ．3 主要溶液及其配制??

10、??????????????????????一1 81 ．4 主要培養(yǎng)基及其配制???????????????????????．．1 81 ．5 主要儀器設(shè)備???????????????????????????1 92 實驗方法???????????????????????????????．1 92 一．屈M 反義基因的獲得和工程菌的構(gòu)建?????????????????1 92 ．1 ．1E ．c o l i 總D N A 的提取?

11、????????????????????2 02 ．1 ．2 引物的設(shè)計與合成??????????????????????。2 02 ．1 ．3P C R 擴增目的片段???????????????????????2 l2 ．1 ．4P C R 產(chǎn)物的電泳鑒定?????????????????????．2 l2 ．1 ．5P C R 產(chǎn)物的回收純化?????????????????????．2 22 ．1 ．6 連接和轉(zhuǎn)化???????

12、??????????????????．2 22 ．1 ．7 重組質(zhì)粒的提取與酶切驗證??????????????????．2 32 ．1 ．8 基因沉默對不同宿主生長的影響????????????????2 42 ．1 ．9 工程菌E ．c o l i T O P l 0 ／p H N F 的敏感性驗證????????????．2 42 ．2F a b I 抑制劑模型篩選方法的建立???????????????????2 52 ．2 ．