運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從HEPS者中篩查艾滋病不易感的關(guān)鍵基因.pdf

1、目的:篩查人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)高暴露持續(xù)血清陰性(highly exposed and persistently seronegative，HEPS)者不易感的關(guān)鍵基因，揭示HEPS者HIV-1不易感的遺傳背景。
　　方法:通過疾病預(yù)防控制中心(Center for Disease Prevention and Control，CDC)艾滋病信息上報(bào)系統(tǒng)，

2、在廣西南寧、柳州、欽州所轄市區(qū)縣的美沙酮門診、艾滋病自愿咨詢檢測門診，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)篩選HIV-1感染者的配偶及固定性伴作為研究對象，同時(shí)以年齡、性別、民族與HEPS組匹配篩選正常人群為對照組。通過問卷調(diào)查收集研究對象的人口學(xué)特征、性行為特征等，并采集研究對象的外周靜脈血。分離外周血單核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cells，PBMCs)，提取樣品RNA后，委托華大基因公司(Beijing Genomic

3、s Institute，BGI)進(jìn)行Hi-Seq2000高通量測序，篩選出關(guān)鍵差異表達(dá)基因，進(jìn)而篩查HIV-1 HEPS者不易感的關(guān)鍵基因。
　　結(jié)果:
　　1.測序質(zhì)檢結(jié)果:(1)堿基組成分析:堿基組成圖顯示兩樣品A、T曲線重合，且G、C曲線也重合;(2)堿基質(zhì)量分析:堿基質(zhì)量圖顯示兩樣品低質(zhì)量(＜20)的堿基比例均較低;(3)片段打斷隨機(jī)性分析:reads在基因上的分布圖顯示兩樣品的reads在基因各部位分布都較均勻;(

4、4)基因覆蓋度分析:C01（對照樣品）總基因數(shù)為16963，覆蓋度為90％～100％的基因有8313個(gè)（約占49％），覆蓋度為0％～10％的基因有1451個(gè)（約占9％）;GH01(HEPS樣品)總基因數(shù)為17125，覆蓋度為90％～100％的基因有8775個(gè)（約占51％），覆蓋度為0％～10％的基因有1427個(gè)（約占8％）。質(zhì)檢結(jié)果顯示:樣品堿基組成均衡質(zhì)量高、片段打斷隨機(jī)性好、基因覆蓋度高，測序結(jié)果質(zhì)檢合格。
　　2.比對結(jié)果:

5、與人類參考基因序列比對，樣品C01共有reads數(shù)47191584，其中比對上的reads數(shù)為33577371(71.15％);樣品GH01共有reads數(shù)47062392，其中比對上的reads數(shù)為31811486(67.59％)。兩樣品clean reads中unique match reads達(dá)到65％以上，perfect match reads達(dá)到50％左右。
　　3.差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì):樣品GH01與樣品C01比較，差異基

6、因共1906個(gè)，其中1139個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，767個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(FDR≤0.001且|log2Ratio|＞1)。差異表達(dá)的基因中包含了15個(gè)與之前報(bào)道和HIV-1不易感相關(guān)的基因:CCL2、KIR2DL1、KIR2DS2、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL2、CCL4、CCL3L1、CCL20、KIR2DL3、CCL3、KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DS4和CCR9。此外，篩選了一批與HIV-1感染復(fù)制有關(guān)，但未

7、見報(bào)道和HIV-1不易感相關(guān)的基因。綜合差異表達(dá)倍數(shù)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，重點(diǎn)關(guān)注的基因主要包括30個(gè):CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL3L3、CCL4、CCL20、CXCL9、CXCL10、CCR4、CCR9、SIGLEC1、SIGLEC14、CH25H、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、HLA-DRB3、HLA-DRB

8、4、HLA-DRB5、HLA-DQA2、HLA-DQB2、HLA-G、APOBEC3A、APOBEC3B。
　　4.差異表達(dá)基因的GO功能富集分析:以corrected p-value≤0.05為閾值，GH01、C01差異表達(dá)基因富集到47個(gè)功能組上，其中細(xì)胞成分5類，分子功能5種和生物過程37種。本研究細(xì)胞成分顯示主要定位在膜上和細(xì)胞表面;分子功能包括細(xì)胞因子活化、受體結(jié)合、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性;參與的生物過程中可能與艾滋病不易感相關(guān)且

9、差異表達(dá)基因富集比例＞10％的主要有:刺激應(yīng)答及其調(diào)節(jié)、生物過程及細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞表面受體信號通路、免疫系統(tǒng)過程及其調(diào)節(jié)等。
　　5.差異表達(dá)基因的KEGG pathway分析:兩樣品間可能與HIV-1不易感相關(guān)的顯著差異表達(dá)的通路主要有7條（按Q value＜0.05），包括:細(xì)胞因子及其受體信號通路、抗原加工提呈通路、粘附分子信號通路、NK細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性通路、吞噬體信號通路、補(bǔ)體系統(tǒng)信號通路和B細(xì)胞受體信號通

10、路。
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選了一批可能與HIV-1不易感性相關(guān)的基因，主要包括趨化因子及其受體家族(Chemokines)、殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體成員(KIRs)、人類白細(xì)胞抗原分子(HLA)、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3家族(APOBEC3)、唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素(SIGLECs)及干擾素刺激基因(ISGs)等，為下一步研究HIV-1不易感的具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　2.