FAM96B缺失重組體的構(gòu)建及其與Apoptin相互作用的研究.pdf

1、FAM96B(familywithsequencesimilarity96,memberB),又名MIP18,CGI-128。該基因定位于染色體上16q22.1-q22.3,其蛋白含有163個(gè)氨基酸,分子量為18kd,該蛋白質(zhì)高度保守。目前有關(guān)FAM96B功能研究的報(bào)道較少,其功能尚未完全闡明。TanakaK研究小組報(bào)道了FAM96B和MMS19、Ciao1、XPD等組成一個(gè)大分子復(fù)合物MMXD,能夠調(diào)節(jié)TFⅡH的活性,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的有

2、絲分裂以及DNA損傷的修復(fù)。如果沉默F(xiàn)AM96B的表達(dá)則導(dǎo)致有絲分裂時(shí)形成多極紡錘體,最后形成異常的多核細(xì)胞。WeiwenYang等報(bào)道FAM96B能夠調(diào)控E2-2蛋白的表達(dá),進(jìn)而在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和微管形成中發(fā)揮作用。從上述材料來(lái)看,FAM96B可能在細(xì)胞的生長(zhǎng)、有絲分裂、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。
　　Apoptin是由雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)編碼產(chǎn)生的一種小分子蛋白

3、,含有121個(gè)氨基酸。它僅誘導(dǎo)具有致瘤表型細(xì)胞或轉(zhuǎn)化表型細(xì)胞的凋亡,而對(duì)人正常細(xì)胞不產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。其細(xì)胞核定位是Apoptin特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。
　　實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)FAM96B能與Apoptin相互作用,并經(jīng)免疫共沉淀證實(shí)了二者在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中均存在這種相互作用。
　　目的：
　　1.探討FAM96B一級(jí)結(jié)構(gòu)上影響其與Apoptin相互作用的肽段。
　　2.探討FAM96B一級(jí)結(jié)構(gòu)上

4、能影響Apoptin亞細(xì)胞定位的肽段。
　　通過(guò)研究FAM96B結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,為FAM96B的功能研究提供新的資料,為Apoptin的誘導(dǎo)凋亡機(jī)制研究提供新的線索和思路。
　　方法：
　　采用分子克隆技術(shù),構(gòu)建帶有myc標(biāo)簽的FAM96B缺失重組真核表達(dá)載體,分別為pcDNA3.1-myc-FAM96B△1(缺失的氨基酸序列為1-42)、pcDNA3.1-myc-FAM96B△2(缺失的氨基酸序列為43-121)、

5、pcDNA3.1-myc-FAM96B△3(缺失的氨基酸序列為122-163),用他們分別與pcDNA3.1-flag-Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,然后提取細(xì)胞總蛋白,通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)FAM96B及其各個(gè)缺失重組體是否與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中發(fā)生相互作用。通過(guò)免疫熒光技術(shù),檢測(cè)FAM96B及其缺失重組體對(duì)Apoptin在HEK293T細(xì)胞中定位的影響。
　　結(jié)果：
　　本研究成功構(gòu)建了三個(gè)FA

6、M96B的缺失重組體。將其各自單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與pcDNA3.1-flag-Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中后,均能夠成功表達(dá)。將FAM96B及各個(gè)缺失重組體分別與pcDNA3.1-flag-Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,結(jié)果表明全長(zhǎng)的FAM96B、FAM96B△1和FAM96B△3與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中均存在相互作用,FAM96B△2與Apoptin在HEK293T細(xì)

7、胞中不能相互作用。將FAM96B及各個(gè)缺失重組體分別與Apoptin共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明全長(zhǎng)的FAM96B、FAM96B△1能使原本應(yīng)該定位于細(xì)胞核的Apoptin重新定位于細(xì)胞質(zhì),而FAM96B△2、FAM96B△3不存在上述作用。
　　結(jié)論：
　　1.在HEK293T細(xì)胞中,全長(zhǎng)的FAM96B、FAM96B△1和FAM96B△3與Apoptin存在直接的相互作用,FAM96B△2與Apo

8、ptin不存在直接的相互作用。說(shuō)明FAM96B△2缺失的區(qū)域是FAM96B與Apoptin直接相互作用的關(guān)鍵區(qū)域,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列范圍為43-121,該區(qū)域在FAM96B與Apoptin相互作用的時(shí)候發(fā)揮重要功能,缺失該區(qū)域后FAM96B與Apoptin不能直接相互作用。
　　2.全長(zhǎng)的FAM96B、FAM96B△1能使原本應(yīng)該定位于細(xì)胞核的Apoptin重新定位于細(xì)胞質(zhì),而FAM96B△2、FAM96B△3不存在上述作用。說(shuō)明F