人B7-H3兩種異構(gòu)體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及鼠抗人B7-H3單克隆抗體的研制.pdf

1、T細(xì)胞的有效活化需要兩條獨(dú)立的但是互補(bǔ)的信號(hào)途徑。第一信號(hào)是抗原遞呈細(xì)胞(APC)遞呈的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物(MHC),與特殊的T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物TCR/CD3識(shí)別,并將信號(hào)傳遞給T細(xì)胞。第二信號(hào)是不可缺少的共刺激信號(hào),它由T細(xì)胞和APC表面的共刺激分子相互作用所激發(fā)。共刺激分子并不僅僅單獨(dú)激發(fā)T細(xì)胞的活化,它們還協(xié)同F(xiàn)CR/CD3復(fù)合物提供增強(qiáng)信號(hào)。T細(xì)胞上的CD28和B7(B7-1和B7-2)相互作用產(chǎn)生的信號(hào),是公認(rèn)的最

2、經(jīng)典的共刺激信號(hào)。共刺激信號(hào)有B7和CD28兩大超家族成員,它們?cè)谡{(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化和耐受中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,有望用于臨床治療。這些通路不僅提供促進(jìn)和維持T細(xì)胞應(yīng)答的正性第二信號(hào),它們同樣能夠下調(diào)T細(xì)胞應(yīng)答,提供必要的負(fù)性第二信號(hào)。負(fù)性共刺激信號(hào)在限制、中斷和減弱T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮效應(yīng),這對(duì)于調(diào)節(jié)T細(xì)胞耐受和自身免疫非常重要。
　　 人B7-H3由于mRNA剪接的不同存在著2IgB7-H3和4IgB7-H3兩種異構(gòu)體。鑒于B7-H3兩

3、種異構(gòu)體的功能差異尚不清楚,因此值得進(jìn)一步深入探討。鑒此,本課題制備了2IgB7-H3和4IgB7-H3兩種異構(gòu)體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,比較分析了B7-H3兩種異構(gòu)體對(duì)T細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。此外,本研究還研制了1株抗人B7-H3單克隆抗體,為進(jìn)一步研究B7-H3分子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　 一、人B7-H3兩種異構(gòu)體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及對(duì)T細(xì)胞刺激作用差異比較
　　 目的:建立2IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和4IgB7-

4、H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,探討B(tài)7-H3兩種異構(gòu)體在介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答中是否存在差異。
　　 方法:RT-PCR法從誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞中克隆人B7-H3兩種異構(gòu)體基因2IgB7-H3和4IgB7-H3的編碼區(qū),經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后插入pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體構(gòu)建pIRES2-EGFP/2IgB7-H3和plRES2-EGFP/4IgB7-H3重組子,采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44。經(jīng)G418抗性篩選

5、,采用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析2IgB7-H3和4IgB7-H3在SHG44細(xì)胞上的表達(dá)。繼而,利用MTT法和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)分析兩種異構(gòu)體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株對(duì)T細(xì)胞體外增殖和細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達(dá)2IgB7-H3和4IgB7-H3的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。體外生物學(xué)功能分析表明,與轉(zhuǎn)染空載體的SHG44/mock細(xì)胞相比,SHG44/2IgB7-H3和SHG44/4IgB7-H3均能有

6、效抑制T細(xì)胞增殖以及對(duì)IFN-γ的分泌,且兩者的協(xié)同抑制作用不存在顯著差異。
　　 結(jié)論:B7-H3兩種異構(gòu)體分子均能負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,但兩者的生物學(xué)功能并不存在顯著的差異。
　　 二、鼠抗人B7-H3單克隆抗體的制備及鑒定
　　 目的:研制鼠抗人B7-H3單克隆抗體,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　 方法:以高表達(dá)人2IgB7-H3和4IgB7-H3的293T細(xì)胞為免疫原,常規(guī)免疫小鼠、細(xì)胞

7、融合和篩選。SHG44/2IgB7-H3和SHG44/4IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為抗體篩選陽(yáng)性細(xì)胞,SHG44/mock基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為抗體篩選陰性細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)篩選和多次亞克隆化,流式細(xì)胞術(shù)分析抗體對(duì)B7家族不同成員基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的識(shí)別。流式細(xì)胞術(shù)分析B7-H3在各類細(xì)胞株上的表達(dá)特性。
　　 結(jié)果:獲得了一株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-H3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株13F8,該單克隆抗體(克