糖尿病下肢血管病變PTA后再狹窄及磺脲類(lèi)藥物胰腺外降糖機(jī)制的研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 糖尿病下肢血管病變球囊擴(kuò)張術(shù)后再狹窄的機(jī)制及磺脲類(lèi)藥物對(duì)其影響
　?、?糖尿病下肢血管病變球囊擴(kuò)張術(shù)后再狹窄發(fā)生機(jī)制的研究
　　目的：
　　1、建立與人下肢血管病變PTA后再狹窄發(fā)病機(jī)制相似的動(dòng)物模型;
　　2、同時(shí)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄動(dòng)物模型，并通過(guò)設(shè)定不同血糖分組對(duì)兩者血管斑塊行對(duì)比研究，以探索動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄發(fā)病機(jī)制的差異及高血糖狀態(tài)對(duì)再狹窄的影響

2、，更好的探究再狹窄發(fā)生機(jī)制。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)分組及模型建立:
　　(1)糖尿病再狹窄vs.非糖尿病再狹窄;
　　(2)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化vs.非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化。
　　選取3月齡新西蘭大耳白兔(～1.7kg)，使用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，再進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)兔分為4組:
　?、偬悄虿≡侏M窄組:a.四氧嘧啶80mg/kg于耳緣靜脈注射以建立1型糖尿病模型（實(shí)驗(yàn)第1周

3、），b.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型（實(shí)驗(yàn)第2周），c.超聲檢測(cè)球囊拉傷部位，觀察拉傷部位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況（手術(shù)結(jié)束4周，實(shí)驗(yàn)第6周），d.對(duì)髂動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成部位行PTA手術(shù)（實(shí)驗(yàn)第6周），建立再狹窄模型;
　?、诜翘悄虿≡侏M窄組:a.生理鹽水于耳緣靜脈注射（實(shí)驗(yàn)第1周），b.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型（實(shí)驗(yàn)第2周），c.超聲檢測(cè)球囊拉傷部位，觀察拉傷部位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況（手術(shù)結(jié)束4周，實(shí)驗(yàn)第6周）

4、，d.對(duì)髂動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成部位行PTA手術(shù)（實(shí)驗(yàn)第6周），建立再狹窄模型;
　?、厶悄虿?dòng)脈粥樣硬化組:a.四氧嘧啶80mg/kg于耳緣靜脈注射建立1型糖尿病模型（實(shí)驗(yàn)第1周），b.超聲檢測(cè)髂動(dòng)脈血管通暢狀況（實(shí)驗(yàn)第6周），c.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型（實(shí)驗(yàn)第6周）;
　?、芊翘悄虿?dòng)脈粥樣硬化組:a.生理鹽水于耳緣靜脈注射（實(shí)驗(yàn)第1周），b.超聲檢測(cè)髂動(dòng)脈血管通暢狀況（實(shí)驗(yàn)第6周），c.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣

5、硬化模型（實(shí)驗(yàn)第6周）。
　　2、糖化血紅蛋白檢測(cè):實(shí)驗(yàn)結(jié)束留取動(dòng)物血樣標(biāo)本測(cè)定糖化血紅蛋白。
　　結(jié)果：
　　1、動(dòng)物一般情況
　　各組實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)血糖基線水平一致。糖尿病組實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射四氧嘧啶1周后，糖尿病模型成功率～66.7％。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，2只糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔及1只糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔死于高血糖;2只非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔及1只非糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔死于超聲檢查;1只非糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)

6、兔及2只糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔死于血栓。
　　2、各組實(shí)驗(yàn)兔體重及血糖情況
　　各組實(shí)驗(yàn)兔體重在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)及結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)水平大致相同，均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。建模前各組實(shí)驗(yàn)兔之間血糖水平無(wú)差異，四氧嘧啶注射1周后糖尿病組實(shí)驗(yàn)兔整體血糖水平升高，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均明顯高于非糖尿病組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相同血糖類(lèi)型模型下的實(shí)驗(yàn)兔血糖之間無(wú)差異（糖尿病再狹窄組vs.糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組，P＞0.05;非糖尿病再狹窄組

7、與非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組，P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔糖化血紅蛋白進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果同各組血糖所反映的狀況一致。
　　結(jié)論：
　　1、本研究通過(guò)模擬人下肢血管病變PTA后血管損傷過(guò)程，對(duì)具有動(dòng)脈粥樣硬化病變的血管行PTA手術(shù)，成功建立與人下肢血管病變PTA后再狹窄相似的理想動(dòng)物模型。
　　2、高糖雖是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，對(duì)再狹窄的發(fā)生、發(fā)展卻影響不大，造成這種差異的主要原因可能是動(dòng)脈粥樣硬化與再狹

8、窄發(fā)生機(jī)制的不同。
　　Ⅱ:磺脲類(lèi)藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移增殖的影響
　　目的：
　　1、在體外細(xì)胞水平，研究不同SUs對(duì)VSMCs增殖及遷移能力的影響。
　　2、探究不同SUs對(duì)VSMCs遷移增殖調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1、人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)培養(yǎng)及分組:
　　HA-VSMC細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，取第4-6代應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下:
　?、貱on

9、trol組;②格列美脲組;③格列本脲組;④格列齊特組。
　　2、免疫熒光方法檢測(cè)HA-VSMC細(xì)胞株SUR2表達(dá)
　　采用細(xì)胞免疫熒光法，檢測(cè)HA-VSMC膜表面SUR2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、免疫熒光方法對(duì)HA-VSMC細(xì)胞株SUR2表達(dá)檢測(cè):HA-VSMC細(xì)胞表面有豐富的SUR2表達(dá)。
　　2、SUs藥物劑量選取結(jié)果
　　對(duì)格列美脲、格列本脲及格列齊特處理的HA-VSMC活力進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算其

10、抑制率，取IC10進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):格列美脲濃度為208μM、格列本脲21μM、格列齊特2000μM。
　　結(jié)論：
　　1、不同SUs對(duì)VSMCs遷移增殖的影響不同，在本實(shí)驗(yàn)所選取的常用SUs中，格列本脲和格列美脲對(duì)VSMCs的遷移及增殖起到促進(jìn)的作用，格列本脲的促進(jìn)作用更為顯著，格列美脲次之，KATP通道開(kāi)關(guān)狀態(tài)在其中扮演著重要角色。
　　2、格列齊特對(duì)VSMCs遷移增殖表現(xiàn)為抑制作用，機(jī)制可能與其SUR選擇性，及在VS

11、MCs上調(diào)控NF-κB通路的活性相關(guān)。
　　第二部分 磺脲類(lèi)藥物——格列齊特的胰腺外降糖作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　1、闡明格列齊特體內(nèi)胰腺外降糖作用的存在。
　　2、探究格列齊特胰腺外降糖作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1、SUR1基因敲基因大鼠的構(gòu)建及培養(yǎng):構(gòu)建SUR1基因敲除大鼠(TALEN基因敲除技術(shù))。并通過(guò)篩選和育種，獲取SUR1-/-大鼠。
　　2、2型糖尿病模型建立及實(shí)驗(yàn)分組<

12、br>　　健康雄性SUR1-/-大鼠，體重～120g左右。高脂飼料喂養(yǎng)，4周后行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及胰島素耐量試驗(yàn)（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT），選取建立胰島素抵抗的SUR1-/-鼠給予腹腔一次性注射27.5mg/kg鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)2周

13、后測(cè)定空腹血糖，連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1 mmol/l，且伴有多飲、多食、多尿癥狀的大鼠被認(rèn)為建模成功。
　　成功建立2型糖尿病的SUR1-/-鼠再次行IPGTT及IPITT檢測(cè)，并隨機(jī)分為3組:①格列齊特組（Gliclazide組，10mg/kg/d）;②二甲雙胍組(Metformin，212.5mg/kg/d);③對(duì)照組（Control組）。通過(guò)灌胃的方式給藥，Control組給予生理鹽水灌胃，喂藥時(shí)間2周。2周后重復(fù)IPG

14、TT及IPITT檢測(cè)，并對(duì)各組實(shí)驗(yàn)鼠行高胰島素-正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，鉗夾結(jié)束后將動(dòng)物安樂(lè)死，取材。
　　結(jié)果：
　　1、SUR1敲基因大鼠構(gòu)建及SUR1-/-鼠培育:Abcc8（SUR1）基因敲除，成功構(gòu)建TALEN載體、線性化載體并倒入胚胎干細(xì)胞、成功篩選同源重組的胚胎干細(xì)胞、通過(guò)顯微注射方式將胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入囊胚、成功獲取嵌合體大鼠并與野生型大鼠雜交獲取雜合體大鼠、再次雜交獲取SUR1-/-大鼠。
　　采用PCR、Sa

15、nger測(cè)序及western blot方法證實(shí)SUR1-/-大鼠獲取成功。
　　2、動(dòng)物一般情況
　　大鼠喂養(yǎng)高脂飼料4周后，經(jīng)測(cè)定全部產(chǎn)生胰島素抵抗。STZ注射后，共27只大鼠血糖達(dá)到2型糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn)，血糖未達(dá)標(biāo)的大鼠被排除出實(shí)驗(yàn)。格列齊特組及對(duì)照組分別有1只實(shí)驗(yàn)鼠在實(shí)驗(yàn)未完成前死亡，死因不詳。
　　結(jié)論：
　　1、格列齊特除傳統(tǒng)的促胰島β細(xì)胞分泌胰島素降糖作用外，還具有胰腺外降糖作用。
　　2、格

16、列齊特胰腺外改善血糖代謝及胰島素抵抗的能力較二甲雙胍弱，其胰腺外降糖作用機(jī)制與二甲雙胍不同，二甲雙胍主要是緩解肝臟組織胰島素抵抗，格列齊特則主要是緩解肌肉及脂肪組織胰島素抵抗。
　　3、格列齊特能明顯促肌肉及脂肪組織中GLUT4的表達(dá)及轉(zhuǎn)位，其作用機(jī)制可能與PPAR-γ及Akt通路激活有關(guān)。
　　SUs一直被認(rèn)為是通過(guò)胰島素促泌作用來(lái)降低血糖，緩解糖尿病患者病情。本研究通過(guò)將SUs胰島β細(xì)胞上作用受體基因——SUR1敲除，S