2型糖尿病伴牙周炎患者頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化能力的研究.pdf

1、目的：糖尿病和牙周炎之間聯(lián)系密切，流行病學(xué)調(diào)查顯示2型糖尿病患者牙周炎的發(fā)病率較高，病變較重，但其發(fā)病機(jī)制仍不甚清晰。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病伴牙周炎患者的牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)分化能力明顯減弱，而對(duì)于2型糖尿病伴牙周炎患者頜骨來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)成骨分化能力的研究目前仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在比較健康者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（H-BMMSCs）、單純牙周炎患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（P-BMMSCs）和2型糖尿病伴牙周炎

2、患者來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（D-BMMSCs）骨向分化能力的差異，以探索頜骨來源的BMMSCs成骨分化能力的改變是否在糖尿病加速牙周炎發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)從健康者、單純牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者磨牙拔除后的牙槽窩內(nèi)取材，以組織塊法體外培養(yǎng)并采用有限稀釋法克隆純化各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞表面抗原分子；分別取各組第三代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)：誘導(dǎo)7天后進(jìn)行堿性磷酸酶染色、ALP定量檢

3、測(cè)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time PCR，RT-PCR）檢測(cè)成骨相關(guān)基因（ALP、COL-I、BSP、Runx-2）的表達(dá)水平；誘導(dǎo)21天后各組進(jìn)行茜素紅染色，對(duì)比礦化結(jié)節(jié)的大小和數(shù)量面積。以對(duì)比觀測(cè)三組細(xì)胞在成骨早、晚期成骨能力的強(qiáng)弱。
　　結(jié)果：
　　1.我們采用體外組織塊法成功分離、培養(yǎng)出H-BMMSCs5例，P-BMMSCs4例， D-BMMSCs3例。原代培養(yǎng)BMMSCs，光鏡下可見3-5天有少許細(xì)胞從

4、骨組織周圍爬出，約3周貼壁至板底的80％,細(xì)胞多呈梭形，胞體較小，胞漿豐滿，也有少量三角形或不規(guī)則形狀細(xì)胞，胞體稍大。通過有限稀釋法克隆篩選出的三組干細(xì)胞傳代后并無(wú)明顯大小、形態(tài)、折光性上的差異，均為長(zhǎng)梭形細(xì)胞形成的旋渦狀排列。
　　2.流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面分子：純化后第三代H-BMMSCs的CD105、CD44、CD90、CD73的陽(yáng)性率分別為98.14%、99.98%、99.42%、99.61%，P-BMMSCs組的分別為9

5、7.90%、99.91%、99.95%、99.93%，D-BMMSCs的分別為93.58%、99.98%、
　　98.27%、99.63%；而其他標(biāo)志物CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR的表達(dá)率分別是0.5%（H-BMMSCs），0.07%（P-BMMSCs），0.5%（D-BMMSCs）。
　　3.成骨誘導(dǎo)能力的比較：成骨誘導(dǎo)7天后，堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示化結(jié) H-BMMSCs組的染色最深，呈深藍(lán)色，P

6、-BMMSCs組次之，D- BMMSCs組最淺，而ALP/AKP定量試劑盒的檢測(cè)值進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ p<0.05）；成骨誘導(dǎo)21天，經(jīng)固定茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)在相同大小的視野下 H-BMMSCs組紅染的鈣化結(jié)節(jié)最多且面積最大，P-BMMSCs組的稍少，而D-BMMSCs組被染色的鈣節(jié)稀少且面積較小。
　　4. RT-PCR結(jié)果：成骨誘導(dǎo)7天后，從3組細(xì)胞中提取mRNA，并各自逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，

7、結(jié)果顯示早期成骨相關(guān)基因ALP、COL-I、BSP、Runx-2表達(dá)情況于D-BMMSCs組最低，P-BMMSCs組次之，H-BMMSCs組最高，其中ALP、COL-I、BSP表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)從糖尿病伴牙周炎患者牙槽骨中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)克隆形成實(shí)驗(yàn)和相關(guān)表面標(biāo)志物的鑒定，證明與從健康人和單純牙周炎患者中提取的BMMSCs一樣，均具有一定的干細(xì)胞特性。盡管三者在細(xì)胞形態(tài)、大小上并無(wú)