異丙酚對(duì)人肝L02細(xì)胞糖氧剝奪-再灌注損傷時(shí)自噬的影響.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷（Hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI）是外科常見的病理生理過程。血液灌流量的減少使肝臟組織發(fā)生缺血性損傷，恢復(fù)血液灌流后，肝細(xì)胞功能代謝及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。研究表明，細(xì)胞的凋亡和自噬存在于肝臟缺血再灌注過程中，肝臟缺血再灌注后細(xì)胞功能代謝障礙加重及結(jié)構(gòu)破壞會(huì)伴隨著自噬活性的升高。
　　自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞的存活是一把雙刃劍。生理情況下，

2、細(xì)胞維持低水平自噬，通過溶酶體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行降解，促進(jìn)細(xì)胞生存；而在氧化應(yīng)激、缺血再灌注等病理情況下，過度的自噬可導(dǎo)致細(xì)胞功能代謝障礙加重及結(jié)構(gòu)破壞甚至引起自噬性的肝細(xì)胞死亡。
　　異丙酚(propofol)是一種烷基酚類的非巴比妥類靜脈麻醉藥，具有高度脂溶性。因其起效迅速、誘導(dǎo)平穩(wěn)、蘇醒迅速而完全、持續(xù)輸注后不易蓄積等優(yōu)點(diǎn)普遍用于麻醉誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜及麻醉維持。目前認(rèn)為，異丙酚能減輕缺血再灌注時(shí)的肝細(xì)胞損傷，改善

3、肝功能、保護(hù)肝臟結(jié)構(gòu)。但其保護(hù)作用的確切機(jī)制尚未完全清楚，可能與其清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、調(diào)節(jié)鈣離子平衡等作用有關(guān)。
　　目的：
　　本研究探討了：1.糖氧剝奪再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R）損傷對(duì)人肝L02細(xì)胞自噬的影響；2.異丙酚對(duì)人肝L02細(xì)胞OGD/R損傷時(shí)自噬的影響，為異丙酚在OGD/R損傷中的肝臟保護(hù)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方

4、法：
　　1.體外培養(yǎng)人肝L02細(xì)胞，制備糖氧剝奪再灌注損傷（OGD/R）模型，模擬臨床的肝臟缺血再灌注損傷。采用隨機(jī)數(shù)字表法將人肝L02細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（Control組）、糖氧剝奪6h/再灌注1h（OGD6/R1）組、糖氧剝奪6h/再灌注3h（OGD6/R3）組、糖氧剝奪6 h/再灌注6h（OGD6/R6）組和糖氧剝奪6 h/再灌注12h（OGD6/R12）組。隨后在倒置顯微鏡下觀察L02細(xì)胞形態(tài)；采用MTT比色法

5、檢測(cè)L02細(xì)胞的相對(duì)增殖情況；免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達(dá)變化。
　　2.體外培養(yǎng)人肝L02細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪6h再灌12h處理，建立OGD/R模型。根據(jù)是否進(jìn)行OGD/R和是否加入異丙酚（PPF）及加入異丙酚的濃度，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（Control組）、糖氧剝奪再灌注（OGD/R）組、糖氧剝奪再灌注＋異丙酚10μmol/L（OGD/R+PPF10）組、糖氧剝奪再灌注＋異丙酚25μmo

6、l/L（OGD/R+PPF25）組、糖氧剝奪/再灌注＋異丙酚50μmol/L（OGD/R+PP50）組、糖氧剝奪再灌注＋異丙酚100μmol/L（OGD/R+PPF100）組。隨后在倒置顯微鏡下觀察L02細(xì)胞的形態(tài)改變；采用MTT比色法檢測(cè)L02細(xì)胞活力；免疫印跡（Western Blot, WB）法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的表達(dá)變化；免疫熒光法檢測(cè)自噬小體的聚集。
　　3.統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)

7、驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x?s）表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P<0.05確定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01確定為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.糖氧剝奪再灌注損傷對(duì)人肝L02細(xì)胞形態(tài)的影響
　　與Control組相比，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，OGD/R組處理L02細(xì)胞的形態(tài)損傷逐漸加劇，呈時(shí)間依賴性。
　　2.糖氧剝奪再灌注損傷對(duì)人肝L02細(xì)胞增殖活性的影響
　　與C

8、ontrol組比較，隨著再灌注時(shí)間的增加，L02細(xì)胞增殖活性逐漸降低，呈時(shí)間依賴性。再灌注1h時(shí)，細(xì)胞增殖率有所降低（P<0.05）;再灌注3h，6h，12h時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.01）。
　　3.免疫印跡法檢測(cè)糖氧剝奪再灌注損傷對(duì)人肝L02細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達(dá)的影響
　　與Control組比較，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1在糖氧剝奪再灌注1h時(shí)即有所增高，隨著再灌注時(shí)間的

9、延長(zhǎng)LC3的表達(dá)量逐漸增高并于再灌注6h時(shí)大量增加，于再灌注12h時(shí)達(dá)到最大值(P<0.01)；Beclin-1蛋白的表達(dá)量隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加于6h和12h急劇增加(P<0.01)；P62蛋白于糖氧剝奪再灌注1h時(shí)和3h無明顯變化(P>0.05)，而在再灌注6h時(shí)開始急劇增加，于12h達(dá)到最大值(P<0.01)
　　4.異丙酚改善糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)損傷的人肝L02細(xì)胞形態(tài)
　　正常培養(yǎng)的Control組和PPF組L0

10、2細(xì)胞形態(tài)正常;OGD/R組細(xì)胞廣泛空泡化，漂浮細(xì)胞明增多；較低濃度（10μmol/L，25μmol/L）異丙酚處理細(xì)胞,狀態(tài)改變不明顯；中等濃度（50μmol/L）及高濃度（100μmol/L）異丙酚處理后，細(xì)胞形態(tài)有所改善。
　　5.異丙酚改善糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)損傷的人肝L02細(xì)胞增殖活性
　　與Control組和PPF組比較，OGD/R組和OGD/R+PPF(10，25，50，100)各組的細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著下降（P<

11、0.01），與OGD/R組比較，較低濃度（10μmol/L，25μmol/L）異丙酚處理后細(xì)胞存活率有所增加（P<0.05）；給予中等濃度（50μmol/L）異丙酚及高濃度（100μmol/L）異丙酚處理后，細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著增加（P<0.01）。
　　6.異丙酚對(duì)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的L02細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1表達(dá)的影響
　　與Control組比較，OGD/R組、PPF組和各濃度異丙酚處理組自噬相關(guān)蛋白L

12、C3、Beclin-1的表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）；與OGD/R組比較，無論是低濃度（10μmol/L，25μmol/L）還是高濃度（50μmol/L，100μmol/L）的異丙酚處理后細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的均表達(dá)下調(diào)（P<0.01）；而在低濃度（10μmol/L）異丙酚處理后，LC3蛋白無明顯變化，提高異丙酚濃度后，其表達(dá)下調(diào)（P<0.01）。
　　7.免疫熒光法檢測(cè)自噬小體的聚集
　　Control組與PPF