抗畜禽支原體中藥復(fù)方肺康明顆粒劑的研制及其化學(xué)成分研究.pdf

1、支原體導(dǎo)致的豬支原體肺炎、雞毒支原體病、牛傳染性胸膜肺炎和山羊傳染性胸膜肺炎給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于目前支原體疫苗的免疫接種效果欠佳，獸醫(yī)臨床常用的泰樂菌素等抗菌藥物耐藥性嚴(yán)重和藥物殘留問題被普遍關(guān)注，急需開發(fā)廉價(jià)、高效、廣譜、無毒的中藥復(fù)方抗畜禽支原體制劑。為進(jìn)一步研制抗畜禽支原體中藥復(fù)方，本課題在前期工作基礎(chǔ)上選取南藥兩面針、廣藿香、南板藍(lán)根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮、土槿皮、艾葉等10味中藥，通過體外微量藥敏試驗(yàn)，結(jié)

2、合中獸醫(yī)理論基礎(chǔ)和中藥藥劑學(xué)理論，篩選出有效的抗畜禽支原體單味中藥及最佳中藥復(fù)方，通過藥效學(xué)試驗(yàn)評(píng)價(jià)最佳中藥復(fù)方的安全性和臨床療效，并將其制成中藥復(fù)方顆粒劑，同時(shí)對(duì)該復(fù)方顆粒劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、初步穩(wěn)定性及其化學(xué)成分研究。具體研究方法與結(jié)果如下。
　　1抗畜禽支原體中藥復(fù)方肺康明確立
　　采用水回流提取法和微量液體稀釋法，對(duì)兩面針、廣藿香、南板藍(lán)根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮、土槿皮、艾葉等10味中藥進(jìn)行體外抗畜禽支原體研究

3、。結(jié)果表明10味中藥中，除了廣藿香、土槿皮和艾葉外，其余7味中藥對(duì)3種畜禽支原體均具有不同程度的體外抑制和殺滅作用；對(duì)照藥物酒石酸泰樂菌素對(duì)試驗(yàn)用3種畜禽支原體均具有較高的敏感性。對(duì)有效的抗畜禽支原體單味中藥進(jìn)行兩兩聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明7味中藥水提液兩兩配伍組合，對(duì)牛支原體、雞毒支原體和羊肺炎支原體的抑制效果表明兩面針、南板藍(lán)根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮間均無拮抗作用，宜配伍。在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，根據(jù)中醫(yī)方劑組成原則及配伍

4、規(guī)律，自擬7組中藥復(fù)方，通過藥敏試驗(yàn)研究表明原復(fù)方和7組中藥復(fù)方均具有不同程度的抗畜禽支原體活性，其中復(fù)方5（南板藍(lán)根、兩面針、白鮮皮）作用最好，且藥味較少，故選用復(fù)方5作為抗畜禽支原體最佳中藥復(fù)方，命名為肺康明。
　　2中藥復(fù)方肺康明藥效學(xué)研究
　　對(duì)健康雛雞進(jìn)行臨床用藥安全性研究，結(jié)果表明中藥復(fù)方肺康明以16 g生藥/d兌水飲用5 d，雞只內(nèi)臟各器官無任何異常，提示該方此劑量對(duì)雞安全。采用1×109 CCU/mL的MG培

5、養(yǎng)物通過雞胸氣囊接種0.5 mL、滴鼻0.3 mL、點(diǎn)眼0.2 mL，以及創(chuàng)造應(yīng)激條件建立人工感染雞毒支原體雞只模型，并通過臨床癥狀、病理觀察、分離培養(yǎng)、鑒定及血清學(xué)診斷，證實(shí)了該疾病模型建立成功。臨床藥效試驗(yàn)結(jié)果表明肺康明高、中劑量組治療 MG人工感染病雞療效顯著。死亡率方面，與感染對(duì)照組比較，各用藥組均有不同程度的下降；肺康明高、中劑量和酒石酸泰樂菌素組死亡率均為0％，肺康明低劑量組和預(yù)防組死亡率很低，分別為5.00%、2.50%。

6、治愈率方面，肺康明高劑量組療效最好（92.5%），明顯優(yōu)于低劑量組，中劑量組與對(duì)照藥物酒石酸泰樂菌素組具有相同的療效（90%）；增重方面，各用藥組均顯著高于感染對(duì)照組，但低于正常對(duì)照組，而肺康明高劑量組與正常對(duì)照組相當(dāng)；料肉比方面，酒石酸泰樂菌素組最低，其他各用藥組與健康組相當(dāng)，感染對(duì)照組最高；血清抗體水平方面，各用藥組均能明顯減少抗體陽性反應(yīng)數(shù)，其中肺康明高劑量組效果最佳；氣囊損傷方面，各用藥組氣囊病變較感染對(duì)照組輕，其中肺康明高劑量

7、組效果最好，其次為復(fù)方肺康明中劑量組和酒石酸泰樂菌素組。提示本復(fù)方對(duì) MG感染具有良好的治療效果，并克服抗生素類藥物長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)，可用于本病的防治。推薦肺康明用于MG雞只的治療量為0.4%兌水飲用給藥濃度，預(yù)防量為0.2%兌水飲用給藥濃度，連續(xù)用藥5 d，每天配換一次藥液。
　　3中藥復(fù)方肺康明顆粒劑制備工藝研究
　　根據(jù)臨床需要、預(yù)試驗(yàn)結(jié)果、生產(chǎn)條件及技術(shù)水平，選擇劑型為顆粒劑。本試驗(yàn)主要以多成分多指標(biāo)綜合評(píng)

8、價(jià)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素考察法進(jìn)行最佳制備工藝篩選，最終確定中藥復(fù)方肺康明顆粒劑的制備工藝為：取處方比例南板藍(lán)根、兩面針、白鮮皮粗粉（10目），精密稱定，加入12倍量的水，浸泡0.5 h，回流提取3次，每次1.5 h，合并3次提取液，超速離心（8000 r/min，15 min）后，真空減壓（溫度60℃，真空度0.08～0.10 MPa，蒸汽壓力≤0.10 MPa）濃縮至相對(duì)密度為1.10（60℃）的流浸膏；取該流浸膏進(jìn)行噴霧干燥，

9、物料溫度：50～60℃，進(jìn)液速度：50～60 mL/min，進(jìn)風(fēng)溫度：165～170℃，出風(fēng)溫度：70～75℃，收集干燥浸膏粉，按干浸膏粉：糊精=1：0.6混勻，過80目篩，采用干式制粒法，設(shè)定軋輥壓力為60～70 kgf/cm2，軋輥轉(zhuǎn)速為12～14 r/min，送粉速度為14～16 r/min制成顆粒1200 g，過篩，分裝，即得。同時(shí)經(jīng)三批中試試制證明，擬定工藝簡(jiǎn)單合理、穩(wěn)定可行，可滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。
　　4中藥復(fù)方肺

10、康明顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及初步穩(wěn)定性研究
　　質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面，主要進(jìn)行原料藥材及輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。原料藥材及輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要對(duì)投料藥材飲片按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版（一部）相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行檢查；輔料—糊精按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版（二部）相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行檢查。顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)中試生產(chǎn)的三批樣品進(jìn)行鑒別、檢查和含量測(cè)定研究。對(duì)方中各味藥均進(jìn)行了薄層色譜鑒別試驗(yàn)，并將南板藍(lán)根、兩面針、白鮮皮的薄

11、層色譜鑒別列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。檢查項(xiàng)下，對(duì)粒度、水分、溶化性、裝量差異、重金屬、砷鹽、微生物限度等進(jìn)行檢查均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄制劑通則ⅠC顆粒劑項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，并將其列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。采用高效液相色譜法對(duì)主要有效成分靛藍(lán)、氯化兩面針堿和白鮮堿進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行了系統(tǒng)方法學(xué)考察，均符合要求，并將含量測(cè)定列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文，根據(jù)多批樣品測(cè)定結(jié)果，制定了主要有效成分的含量限度，暫定本品每袋（5.0 g）含南板藍(lán)根以靛

12、藍(lán)計(jì)，不得低于773.08μg；兩面針以氯化兩面針堿計(jì)，不得低于846.84μg；白鮮皮以白鮮堿計(jì)，不得低于3301.67μg。初步穩(wěn)定性研究方面，加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明樣品采用鋁塑復(fù)合膜袋為包裝材料在考察期內(nèi)其性狀、鑒別、檢查等各項(xiàng)考察指標(biāo)均符合本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案規(guī)定，提示本品在高溫高濕條件下貯存6個(gè)月，可保證質(zhì)量穩(wěn)定。長(zhǎng)期穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果表明9個(gè)月的考察期內(nèi)其性狀、鑒別、檢查等各項(xiàng)考察指標(biāo)均符合本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，提示本品在常溫條件下保存

13、9個(gè)月，可保證質(zhì)量穩(wěn)定；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)間為24月末，其后續(xù)工作仍在進(jìn)行當(dāng)中。
　　5中藥復(fù)方肺康明化學(xué)成分研究
　　按處方量的200倍稱取南板藍(lán)根、兩面針、白鮮皮粗粉，以水回流提取，提取液經(jīng)減壓濃縮和噴霧干燥后，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行部位分離后，采用反復(fù)硅膠柱色譜及重結(jié)晶等方法進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分分離與純化，并根據(jù)理化常數(shù)測(cè)定和光譜測(cè)定（EI-MS或 EIS-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept等）所得數(shù)據(jù)以及文

14、獻(xiàn)對(duì)照確定了21單體化合物的結(jié)構(gòu)，分別為：氯化兩面針堿（nitidine chloride，1），大黃酚（chrysophanic acid，2），熊果酸（ursolic acid，3），靛藍(lán)（indigotin，4），靛玉紅（indirubin，5），硬脂酸（stearic acid，6），辛夷脂素（fargesin，7），補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（psoralen，8），木犀草素（luteolin，9），香草醛（vanillin，10），棕櫚酸（

15、palmitic acid，11），大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（emodin-8-O-β-D-glucopyranoside，12），槲皮苷（quercetin-3-rhamnoside，13），梣酮（fraxinellone，14），黃柏酮（obacunone，15），檸檬酸（citric acid，16），白屈菜堿（chelidonine，17），腺苷（adenosine，18），胞苷（cytidine，20），黃芩苷（b

16、aicah，20），苯甲酸（benzoic acid，21）。其中化合物3、7、10～13、16～17、19～21均首次在組成肺康明的3味中藥南板藍(lán)根、兩面針和白鮮皮中發(fā)現(xiàn)。綜上所述，本課題通過體外抑菌試驗(yàn)對(duì)10味中藥進(jìn)行篩選，確定了最佳中藥復(fù)方，命名肺康明，對(duì) MG感染具有良好的治療效果，使用安全。對(duì)該方進(jìn)行顆粒劑制備工藝研究，其工藝簡(jiǎn)單合理、穩(wěn)定可行，可滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。其制劑基本穩(wěn)定，安全性高，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定、可控。同時(shí)從該方