周期性動態(tài)壓力對hPDLSCs-PRF間接共培養(yǎng)體系中力生長因子表達的影響.pdf

1、牙周膜組織是牙齒重要的支持組織，具有較強的適應(yīng)性改建能力，這與其在咀嚼功能狀態(tài)下不斷承受周期性的咬合輕力刺激有關(guān)。2004年，隨著牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）的成功分離與培養(yǎng)，大量的研究已經(jīng)證實，牙周膜干細胞是牙周膜組織中增殖分化能力較強的細胞簇，應(yīng)力刺激下其活性高低直接關(guān)系到牙周組織的健康。研究表明，將體外培養(yǎng)的PDLSCs用于脫位牙再植，可促進患牙牙周愈合，但愈合效果

2、并不理想。分析原因主要為以下三個方面：PDLSCs單細胞懸液易流失；體外培養(yǎng)的PDLSCs其增殖及分化缺乏生長因子調(diào)控；體外培養(yǎng)的PDLSCs缺少體內(nèi)生物力學微環(huán)境的調(diào)控。針對前兩個問題，本課題組在前期研究中將體外培養(yǎng)的PDLSCs誘導形成細胞膜片，防止細胞流失。并且制備富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin, PRF）為PDLSCs的生長提供支架及生長因子微環(huán)境。前期研究將PDLSCs和PRF構(gòu)建為PDLSCs/P

3、RF雙膜復合體用于脫位牙再植，結(jié)果表明該復合體可有效促進脫位再植牙的牙周愈合。但作為牙齒的支持組織，牙周膜需承受咀嚼力、咬合力、正畸力等多種應(yīng)力刺激，這種生物力學微環(huán)境在牙周膜再生修復中至關(guān)重要。大量臨床研究表明無論采用何種促牙周再生的措施，對再植牙施以彈性固定，保持其生理動度和咬合力刺激在牙周膜再生中必不可少，但其機理尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，機體組織中存在一種力生長因子（mechano-growth factor,MGF）該因子為力學敏感

4、因子，在正常組織中不表達，但當組織受到損傷或應(yīng)力刺激后該因子會被誘導表達。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌肉、神經(jīng)、心臟等多種組織損傷或受應(yīng)力刺激后可表達MGF，但其在牙周組織中的表達及功能尚未見報道。
　　目的：本實驗以本課題組前期研究為基礎(chǔ)，制備hPDLSCs/PRF（human periodontal Ligament Stem Cells/PRF，hPDLSCs/PRF）間接共培養(yǎng)體系，并對其加載周期性動態(tài)壓力，分析動態(tài)壓力作用下 hPDL

5、SCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中 MGF在 hPDLSCs中的響應(yīng)以及hPDLSCs的增殖和分化，為進一步探討咬合力促進牙周再生的機理提供實驗基礎(chǔ)，也為牙撕脫性損傷的臨床治療提供新的思路與契機。
　　本實驗分為三個部分：
　　實驗一：hPDLSCs的分離培養(yǎng)及細胞膜片的構(gòu)建。
　　聯(lián)合應(yīng)用組織塊法與酶消化法分離培養(yǎng)人牙周膜細胞，并用有限稀釋法分離hPDLSCs，采用表面標記物鑒定、克隆形成率測定、成骨誘導和成脂誘導對其干

6、細胞特性進行鑒定。采用 MTT法測定 hPDLSCs的生長曲線。利用成膜誘導液將hPDLSCs誘導形成細胞膜片。結(jié)果表明：采用有限稀釋法能分離得到的hPDLSCs具有良好的增殖及克隆形成能力，表達間充質(zhì)干細胞表面標志分子，并且具有向成脂、成骨向細胞分化的潛能。且誘導形成的細胞膜片具有豐富的細胞外基質(zhì)。
　　實驗二：動態(tài)壓力對hPDLSCs增殖分化的影響及其MGF響應(yīng)。
　　對體外培養(yǎng)的hPDLSCs及細胞膜片加載0-90 k

7、Pa、0-120 kPa、0-150 kPa、﹣20-90 kPa、﹣20-120 kPa、﹣20-150 kPa、﹣40-90 kPa、﹣40-120 kPa和﹣40-150 kPa，頻率為0.1 Hz，持續(xù)時間為1h的周期性動態(tài)壓力。采用CCK-8法檢測hPDLSCs細胞活性，Real-time PCR法檢測細胞膜片中MGF、IGF-1、Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA基因表達水平。結(jié)果表明：0-120 kPa及﹣20-12

8、0 kPa的周期性動態(tài)壓力作用下hPDLSCs細胞活性顯著增強。且各組壓力作用后12 h至36 h，hPDLSCs膜片中MGF基因的表達水平顯著增高，且MGF在壓力作用后24h達到表達高峰。其中0-120 kPa壓力作用下MGF的表達量最高，而﹣20-120 kPa作用下MGF的表達量次之；此外，研究發(fā)現(xiàn)0-120 kPa壓力作用下Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA基因的表達量顯著增高。根據(jù)以上結(jié)果，本研究篩選出MGF表達量較高的

9、兩個壓力值0-120 kPa和﹣20-120 kPa作為后續(xù)實驗的壓力加載條件。
　　實驗三:動態(tài)壓力對 hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中hPDLSCs分化的影響及其MGF響應(yīng)
　　選取0-120 kPa、﹣20-120 kPa對hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系進行周期動態(tài)力學加載。采用Real-time PCR法檢測間接共培養(yǎng)體系中MGF、IGF-1、Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA mRNA的表達水平，

10、采用Western Blotting法和免疫組化法檢測間接共培養(yǎng)體系中的MGF與IGF-1蛋白的表達。結(jié)果表明：0-120 kPa與﹣20-120 kPa壓力作用下hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中的MGF、IGF-1 mRNA的表達量顯著增高。且與壓力作用下 hPDLSCs膜片相比，壓力作用下的間接共培養(yǎng)體系中 MGF mRNA的表達量顯著升高。0-120 kPa作用下的hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中Col-Ⅰ、ALP、R

11、UNX2和PCNA mRNA的表達量顯著增高。而﹣20-120 kPa作用下僅Col-Ⅰ及PCNA mRNA表達量顯著升高。0-120 kPa與﹣20-120 kPa壓力作用下hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系中MGF蛋白的表達量顯著增高，且高于hPDLSCs膜片組。
　　結(jié)論：在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建出hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系。并且模擬牙周膜在體內(nèi)所承受的咬合力，對體外培養(yǎng)的hPDLSCs及hPDLSC

12、s/PRF間接共培養(yǎng)體系加載周期性動態(tài)力學刺激，觀察力學環(huán)境下hPDLSCs膜片及間接共培養(yǎng)體系中hPDLSCs增殖分化及MGF響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)適宜的周期性動態(tài)壓可促進hPDLSCs的增殖與分化，并誘導MGF表達，且在壓力作用之后的24h， MGF達到表達峰值。本研究首次發(fā)現(xiàn)周期性動態(tài)壓力作用下hPDLSCs中表達MGF。研究還發(fā)現(xiàn)適宜的周期性動態(tài)壓力可促進 hPDLSCs/PRF間接共培養(yǎng)體系 hPDLSCs的增殖與分化，且PRF與適宜