SND1在肝細(xì)胞中影響胰島素受體信號(hào)通路的研究.pdf

1、目的：
　　2型糖尿病是世界范圍內(nèi)最為嚴(yán)重的代謝疾病之一，其發(fā)病基礎(chǔ)是胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能障礙和外周組織的胰島素抵抗。研究表明主要的分子機(jī)制之一是肝、肌肉、脂肪等胰島素靶器官的胰島素受體信號(hào)受損，引起胰島素抵抗進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。SND1是一種廣泛存在的多功能蛋白，具有高度的保守性。近期研究表明SND1蛋白可以與PPARγ直接結(jié)合，并在脂肪細(xì)胞中特異性的結(jié)合到PPARγ靶基因的PPRE區(qū)，作為轉(zhuǎn)錄共激活因子調(diào)控脂肪細(xì)胞的分

2、化。高脂飲食處理后，SND1過(guò)表達(dá)小鼠體內(nèi)可以看到肝臟脂肪變性的減輕及胰島素敏感性的提高。上述結(jié)果提示 SND1蛋白參與了脂肪和肝臟的胰島素抵抗過(guò)程，可以影響肝和脂肪等胰島素敏感組織對(duì) Insulin刺激的反應(yīng)。本課題在已有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上探討 SND1在肝細(xì)胞中對(duì)胰島素受體信號(hào)通路的影響，并探討可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　本課題以HepG2細(xì)胞和小鼠原代肝細(xì)胞為研究模型，研究SND1在肝細(xì)胞中的作用。通過(guò)對(duì)SND1敲

3、低（Knock Down，KD）和轉(zhuǎn)入空載（Control，Ctrl）的 HepG2細(xì)胞進(jìn)行棕櫚酸鹽（Palmitate，Palm）刺激模擬高脂刺激條件，油紅O染色觀察兩種細(xì)胞的脂質(zhì)積累進(jìn)而確定 SND1對(duì)肝細(xì)胞脂肪積累的影響；對(duì)HepG2 KD和Ctrl細(xì)胞，以及提取的SND1過(guò)表達(dá)小鼠（Transgenosis，Tg）和野生型小鼠（Wlid Type，WT）的原代肝細(xì)胞進(jìn)行Palm處理24h后給予短時(shí)相的胰島素刺激，Western-

4、Blot檢測(cè)胰島素受體β（Insulin Receptor，IRβ）、p-Akt等胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平來(lái)確定 SND1對(duì)高脂刺激后肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的作用；通過(guò)放線(xiàn)菌酮（ Cycloheximide，CHX）和蛋白酶體抑制劑MG132處理HepG2 KD和Ctrl細(xì)胞，在長(zhǎng)時(shí)間Insulin刺激后觀察IRβ的變化，進(jìn)而分析SND1影響胰島素受體含量的機(jī)制；采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)SND1基因、Insr和Smu

5、rf1基因的表達(dá)情況，并采用Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SND1與IRβ、E3泛素連接酶Smurf1的蛋白結(jié)合等實(shí)驗(yàn)研究SND1介導(dǎo)IRβ泛素化降解的具體機(jī)制，
　　結(jié)果：
　　1. SND1可以減少高脂狀態(tài)下肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累，無(wú)論在小鼠原代肝細(xì)胞還是人肝癌細(xì)胞系HepG2中，SND1蛋白都體現(xiàn)出提高細(xì)胞內(nèi)p-IRS1、p-Akt水平，提高肝細(xì)胞的胰島素敏感性。
　　2.對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的高脂刺激可以加速 IRβ的降解，這一過(guò)

6、程需要SND1的參與。
　　3. CHX和MG132的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SND1是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑影響IRβ的降解。
　　4.HACT類(lèi)的E3泛素連接酶Smurf1與SND1的蛋白表達(dá)和mRNA水平在不同刺激時(shí)都保持一致，但是其不與SND1結(jié)合。IRβ與SND1的Co-IP實(shí)驗(yàn)也顯示SND1不與IRβ結(jié)合，但Smurf1可以結(jié)合IRβ。
　　結(jié)論：
　　1.SND1可以提升高脂狀態(tài)下肝細(xì)胞的胰島素敏感性，并減輕