骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)慢性期脊髓損傷的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化探索.pdf

1、目的：
　　建立與臨床相似的創(chuàng)傷性慢性期脊髓損傷（Spinal Cord Injury, SCI）大鼠模型，通過核磁共振彌散張量技術(shù)（Diffusion Tensor Imaging, DTI）和彌散纖維束示蹤成像技術(shù)（Diffusion Tensor Tracking, DTT）對(duì)動(dòng)物模型和治療方法進(jìn)行評(píng)估，創(chuàng)立核磁共振介導(dǎo)的大鼠創(chuàng)傷性脊髓空洞內(nèi)定位移植的方法，進(jìn)而探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived m

2、esenchymal stem cells, BMSCs）移植修復(fù)慢性期脊髓損傷的療效、最佳劑量及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型制作以PSI-IH Impactor制作大鼠脊髓T10挫裂傷模型，連續(xù)6w每周對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行BBB評(píng)分、核磁共振常規(guī)掃描、彌散張量成像和彌散纖維束示蹤成像檢測(cè)。
　　2.脊髓空洞內(nèi)定位移植以慢性期SCI大鼠為對(duì)象，以Fe3O4磁性納米粒子為移植物，通過大鼠的體表定位，在MRI介導(dǎo)下分

3、別行2次獨(dú)立的8μl磁性納米粒子脊髓空洞內(nèi)定位移植。
　　3. BMSCs分離培養(yǎng)采用全骨髓分離法分離培養(yǎng)BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和光鏡下觀察對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　4. BMSCs移植修復(fù)慢性期 SCI以脊髓空洞內(nèi)定位移植的方法，分別將DMEM、4×105、8×105和1×106的BMSCs移植到慢性期SCI動(dòng)物模型的損傷區(qū)域。移植后連續(xù)觀察8周，分別采用BBB評(píng)分和旋轉(zhuǎn)測(cè)試評(píng)估SCI大鼠功能恢復(fù)情況，采用樣品的肉眼觀察、

4、MRI常規(guī)T2掃描、DTT和DTI分析、免疫熒光、HE染色的方法分析大鼠局部損傷區(qū)域變化，通過對(duì)脊髓組織切片的MAP2、Nestin、Tublin、GFAP、VEGF和 BDNF的免疫熒光染色，探討分析不同濃度BMSCs對(duì)慢性期脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)、膠質(zhì)瘢痕清除、血管重塑及營養(yǎng)因子旁分泌的作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立大鼠慢性期SCI動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物無死亡及感染跡象， SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w

5、的大鼠BBB評(píng)分為4.21±0.35、5.08±0.72、5.79±0.88、6.12±0.69、6.39±0.55、6.44±0.62，MRI常規(guī)掃描可見損傷區(qū)域膠質(zhì)瘢痕清晰和髓內(nèi)高信號(hào)液腔空洞，該空洞可分為3類即：中央型、分裂型、彌散型。
　　SCI后局部損傷區(qū)域和液腔空洞于SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w的體積分別為0 mm3、（0.21±0.35） mm3、（2.21±0.44） mm3、（3.18±0.82）

6、mm3、（3.27±0.79）mm3和（3.31±0.73）mm3。DTI分析提示，SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w損傷區(qū)域的 ADC值分別為（2351.91±780.73）×10-6mm2/s、（2033.22±720.11）×10-6mm2/s、（1972.10±710.31）×10-6mm2/s、（1604.22±720.51）×10-6mm2/s、（1550.62±656.11）×10-6mm2/s和（1549.71±

7、660.73）×10-6mm2/s，F(xiàn)A值分別為0.30±0.06、0.31±0.07、0.32±0.07、0.33±0.09、0.34±0.08和0.34±0.08。
　　2. MRI介導(dǎo)下完成損傷空洞內(nèi)定位移植，SCI空洞體積由（5.71±0.21）mm3降低至（3.23±0.36）mm3，經(jīng)過二次重復(fù)操作驗(yàn)證后，脊髓空洞的體積由（3.23±0.36）mm3降低至（1.48±0.72）mm3，移植操作成功，并且該方法具有可重復(fù)

8、性。
　　3.經(jīng)流式細(xì)胞儀篩查分析，BMSCs的免疫表型為：CD105、CD90和CD44陽性，CD45和CD34陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征，并且提示細(xì)胞樣品中不存在造血系統(tǒng)的細(xì)胞污染。
　　4.順利完成細(xì)胞定位移植，移植后即刻進(jìn)行MRI掃描可見移植物位于損傷中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無死亡、感染或致瘤跡象。大鼠功能恢復(fù)評(píng)估結(jié)果提示，相較DMEM組，細(xì)胞移植組均有不同程度的改善（p<0.05），1×106細(xì)胞組改善最為明顯。通過肉

9、眼觀察、MRI常規(guī)掃描、DTT和DTI分析、免疫熒光和HE染色分析對(duì)大鼠局部損傷區(qū)域的變化分析，結(jié)果提示，相較DMEM組，細(xì)胞移植組均有不同程度的改善（p<0.05），1×106細(xì)胞組改善最為明顯。脊髓組織切片的MAP2、Nestin、GFAP、Tublin、VEGF和BDNF的免疫熒光染色結(jié)果提示不同濃度BMSCs對(duì)慢性期SCI后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、膠質(zhì)瘢痕清除、血管重塑及營養(yǎng)因子旁分泌作用療效不同，其中1×106細(xì)胞組改善最為明顯。

10、r>　　結(jié)論：
　　大鼠慢性期脊髓損傷模型于傷后4w成熟，彌散張量成像技術(shù)和彌散纖維束示蹤成像是診斷和評(píng)估損傷程度及治療手段的高效量化方法，損傷局部骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠慢性期脊髓損傷是一種行之有效的修復(fù)手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過其在神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)、膠質(zhì)瘢痕清除、血管重塑及營養(yǎng)因子旁分泌的作用機(jī)制對(duì)慢性期脊髓損傷進(jìn)行多層面的修復(fù)，本研究結(jié)果提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠慢性期脊髓損傷最佳適用劑量為5×106細(xì)胞/kg，為骨髓間