HIF-1α基因多態(tài)性與紫紺型先天性心臟病低氧耐受的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：
　　先天性心臟病（Congenital Heart Disease, CHD）是兒科最常見的心血管疾病，從2009年至今，CHD一直是我國(guó)最常見的出生缺陷，同時(shí)也是嬰兒致死的首要原因。目前世界范圍的活產(chǎn)新生兒CHD的發(fā)病率為8‰-12‰。其中紫紺型先天性心臟病(Cyanotic Congenital Heart Disease, CCHD)是 CHD最嚴(yán)重的一種類型，其發(fā)病率約占 CHD的10%-20%。紫紺型先天性心臟病

2、(CCHD)患兒因心臟結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致低氧靜脈血直接流入體循環(huán)而出現(xiàn)紫紺的共同臨床表現(xiàn)，低氧血癥是CCHD常見癥狀，也是最主要的死亡原因。CCHD患兒低氧血癥較非紫紺型先天性心臟病（Acyanotic Congenital Heart Disease, ACHD）患兒更嚴(yán)重，長(zhǎng)期慢性的低氧血癥嚴(yán)重影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，耐受低氧環(huán)境是CCHD個(gè)體存活的基礎(chǔ)。在臨床中經(jīng)?？梢杂^察到相同結(jié)構(gòu)畸形、同等低氧情況下，不同個(gè)體臨床表現(xiàn)及預(yù)后均不同，說(shuō)明不

3、同個(gè)體對(duì)低氧的耐受能力不同，且CCHD個(gè)體的低氧耐受能力在一定程度上受個(gè)體遺傳背景的影響。
　　低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是一種低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的，可以激活低氧反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞在低氧狀態(tài)下的生存。這揭示了HIF-1α基因可能與CCHD低氧耐受存在一定相關(guān)性。國(guó)內(nèi)已有研究證實(shí)慢性低氧上調(diào)CCHD患兒心臟組織HIF-1α蛋白表達(dá)，該作用可能參與CCH

4、D患兒耐受低氧。大量研究證實(shí)許多疾病的病情進(jìn)展和預(yù)后與特殊基因多態(tài)性位點(diǎn)密切相關(guān)，但目前 HIF-1α基因多態(tài)性與 CCHD低氧耐受的相關(guān)性尚不明確。
　　目的：
　　研究 HIF-1α基因多態(tài)性和 CCHD患兒低氧耐受能力的關(guān)系，揭示CCHD個(gè)體遺傳背景在耐受低氧過(guò)程中的作用，為指導(dǎo)臨床預(yù)后和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　抽提97例CCHD患兒和108例ACHD患兒外周抗凝血的基因組DNA；利用靶向

5、捕獲技術(shù)，針對(duì)HIF-1α外顯子、3'UTR、5'UTR及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2kb區(qū)域進(jìn)行二代測(cè)序；對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析篩選HIF-1α基因多態(tài)性位點(diǎn)；以卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較各多態(tài)性位點(diǎn)等位基因和基因型在CCHD組和ACHD組中分布的差異；對(duì)關(guān)聯(lián)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，PCR克隆所有樣本目的DNA片段后Sanger測(cè)序，驗(yàn)證二代測(cè)序的正確性。
　　根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用 PCR技術(shù)克隆 HIF-1α啟動(dòng)子區(qū)含-1496多態(tài)位點(diǎn)的

6、目的基因片段；將-1496位點(diǎn)不同基因型目的片段分別插入到pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告基因載體中并酶切測(cè)序鑒定，最后構(gòu)建出2種熒光素酶表達(dá)載體（pGL3-Basic-HIF-1α-AA和pGL3-Basic-HIF-1α-DD）；將重組質(zhì)粒脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染至HEK293T和H9C2細(xì)胞；用雙熒光素酶檢測(cè)試劑測(cè)定細(xì)胞裂解液熒光素酶活性；以SPSS17.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和2×2析因設(shè)計(jì)資料方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同基因型不同氧

7、濃度下HIF-1α啟動(dòng)子活性的差異。
　　結(jié)果：
　　從97例 CCHD患兒和108例 ACHD患兒外周抗凝血的基因組DNA中，篩查出33個(gè)高頻多態(tài)位點(diǎn)（最小等位基因頻率MAF＞10%）。其中僅 HIF-1α轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1496位點(diǎn) A＞D（D代表單堿基缺失突變），在NCBI上的SNP序列號(hào)為rs138141447，其等位基因頻率，CCHD組與 ACHD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。rs138141447位點(diǎn)

8、Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果93.2%與二代測(cè)序結(jié)果一致。Sanger測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，HIF-1α啟動(dòng)子-1496位點(diǎn)，CCHD組等位基因頻率 A和D分別為77.8%和22.2%；ACHD組為89.4%和10.6%（χ2=10.04，P＜0.01）。CCHD組HIF-1α啟動(dòng)子AA、AD、DD基因型頻率分別為58.76%，38.14%和3.1%，ACHD組為78.7%，21.3%和0%（χ2=12.42，P＜0.01）。
　　經(jīng)酶

9、切測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建出-1496位點(diǎn)不同基因型HIF-1α啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體；在 HEK293T和 H9C2細(xì)胞中，通過(guò)比較不同基因型熒光素酶表達(dá)載體（pGL3-Basic-HIF-1α-AA和pGL3-Basic-HIF-1α-DD）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光素酶相對(duì)活性，發(fā)現(xiàn)DD基因型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性明顯高于 AA基因型的活性，相同氧濃度下不同基因型重組質(zhì)粒熒光素酶相對(duì)活性比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），相同基因型重組質(zhì)粒在不同氧濃

10、度下熒光素酶相對(duì)活性比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），不同基因型和不同氧濃度的交互效應(yīng)P＞0.05，認(rèn)為不同氧濃度對(duì)不同基因型重組質(zhì)粒熒光素酶相對(duì)活性無(wú)影響。
　　結(jié)論:
　　測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn) HIF-1α啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn) rs138141447，其等位基因頻率和基因型頻率，CCHD組和ACHD組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CCHD組D等位基因頻率明顯高于ACHD組。該位點(diǎn)可能與CCHD低氧耐受存在一定的關(guān)聯(lián)。
　　熒光素酶