雷公藤多苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織纖維化影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）患者最主要的微循環(huán)并發(fā)癥發(fā)生于腎臟的表現(xiàn)，主要累及腎小球，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率增高，蛋白濾過(guò)增加，出現(xiàn)大量蛋白尿，同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎?。‥nd stage renal disease, ESRD）的最主要原因。隨著DM患病人數(shù)的與日俱增，如何防止 DN發(fā)生及進(jìn)展越來(lái)越獲得普遍關(guān)注。既往很多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷(

2、Tripterygium Wilfordii Polyglucosides, TWP)有較強(qiáng)的抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用，其作用特點(diǎn)是多部位，多靶點(diǎn)，既能作用于T細(xì)胞、樹(shù)突狀免疫細(xì)胞等，又可抑制炎癥因子、粘附因子、趨化因子等分泌，從而達(dá)到治療多種自身免疫性疾病的效果。近幾年大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TWP可通過(guò)抗炎、免疫抑制作用減輕足細(xì)胞和基底膜受損程度，從而降低尿白蛋白排出，緩解腎小球硬化程度，延緩DN的發(fā)展過(guò)程，但 TWP對(duì) DM大鼠腎臟纖維化及細(xì)

3、胞外基質(zhì)（ Extracellular matrix，ECM）沉積的作用機(jī)理尚不清楚。既往很多研究集中于 TGF-β1/Smad信號(hào)通路在心臟纖維化、肺纖維化及腎纖維化過(guò)程中的作用，但對(duì)TGF-β1/NF-κB信號(hào)通路對(duì)腎纖維化的作用機(jī)理尚未明確。因此，本研究以高糖高脂飲食聯(lián)合尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)行造模的DM大鼠為研究對(duì)象，采用ELISA方法、q-PCR方法、Western印跡方法及免疫組化方法，旨在研究TWP對(duì)TGF-β1/

4、NF-κB信號(hào)通路的影響，從而進(jìn)一步明確TWP對(duì)DM大鼠腎組織纖維化的作用。
　　方法:
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠70只，按照隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組（NC組，n=10）喂養(yǎng)常規(guī)飼料。其余60只大鼠高糖、高脂飼料喂養(yǎng)8周后予尾靜脈注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ，30mg/kg）建立2型糖尿病（T2DM）模型。將造模成功后的大鼠再隨機(jī)分為模型對(duì)照組（DM）、根據(jù)應(yīng)用TWP劑量的多少進(jìn)一步分為低（

5、tripterygium glycosides，L-TWP，1mg/kg?d）、中（tripterygium glycosides，M-TWP，3mg/kg?d）、高（tripterygium glycosides， H-TWP，6mg/kg?d）劑量,每組各15只。造模成功后即開(kāi)始灌胃， NC組和DM組以等量蒸餾水（2ml）灌胃，灌胃8周末處死取材。飼養(yǎng)動(dòng)物期間按時(shí)記錄大鼠體重（BW）、血糖、24小時(shí)尿微量白蛋白（UMA）變化；處死大

6、鼠階段記錄 BW、腎重（KW）；留取血標(biāo)本檢測(cè)血糖、肝腎功能、血脂及血常規(guī)；采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TGF-β1、NF-κBp65、IV型膠原（Collagen IV，COL-IV）、纖連蛋白（Fibronection，F(xiàn)N）、層粘連蛋白（Laminin，LN）；留取腎組織標(biāo)本，光鏡下觀察大鼠腎組織腎小球病理改變；采用q-PCR法、Western印跡法分別從基因水平、蛋白水平檢測(cè)大鼠腎組織中 TGF-β1、NF-κBp65、COL

7、-IV、FN、LN水平，采用免疫組化法檢測(cè)上述各因子蛋白表達(dá)的腎組織定位情況。
　　結(jié)果:
　　1.與NC組相比，高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠血甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β）高于NC組(P<0.05)；STZ注射后大鼠較NC組大鼠體重降低，同時(shí)伴有多飲、多尿、多食等癥狀表明T2DM大鼠造模成功。
　　2.一般指標(biāo)：①體重、

8、血糖：與NC組相比，DM組大鼠造模后血糖顯著上升（P<0.05），體重顯著減輕（P<0.05）；②腎重指數(shù)（KW/BW）：與NC相比， DM組大鼠KW/BW明顯升高（P<0.05），TWP治療組中，KW/BW均有所下降（P<0.05），以H-TWP組下降最為顯著（P<0.05）；③血脂：與NC組相比，DM組大鼠TG、TC水平顯著升高（P<0.05），TWP治療組未見(jiàn)顯著改變（P>0.05）；④肝、腎功能、血常規(guī)：大鼠肝、腎功能和血常規(guī)在

9、各組間均無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　3.24h尿微量白蛋白（24h UMA）：①與NC組相比，DM組大鼠UMA水平顯著升高（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組大鼠UMA水平顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。
　　4．各組大鼠腎小球病理形態(tài)學(xué)變化：NC組腎組織結(jié)構(gòu)正常；DM組HE染色可見(jiàn)腎組織內(nèi)大片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Masson染色可見(jiàn)腎組織出現(xiàn)明顯纖維化，PAS染色可見(jiàn)腎小球基底膜增厚。經(jīng)不同劑量TWP干預(yù)

10、后，上述病理改變明顯減輕，且呈劑量依賴性改善。
　　5.采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN水平：①與NC組相比，DM組血清TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN含量明顯增多（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組血清TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN含量顯著下降（P<0.05），且呈劑量依賴性下降。
　　6.應(yīng)用q-PCR法

11、檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN mRNA的表達(dá)：①與NC組相比，DM組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN mRNA表達(dá)水平顯著增多（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組腎組織中 TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性降低。
　　7.應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1

12、、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表達(dá)：①與NC組相比，DM組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表達(dá)顯著增多（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05），且呈劑量依賴性下降。
　　8.應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表達(dá)

13、：與NC組相比，DM組腎小球內(nèi)可見(jiàn)標(biāo)記的TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN細(xì)胞浸潤(rùn)（P<0.05）；TWP組可見(jiàn)腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表達(dá)明顯降低（P<0.05），M-TWP組、H-TWP組較L-TWP組下降更加明顯（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1. TGF-β1介導(dǎo)腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，NF-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路所起的作用不容忽視。TWP干預(yù)組較

14、DM組大鼠KW/BW、24h UMA及病理改變均有所改善，且呈劑量依懶性。
　　2.雷公藤多苷具有獨(dú)特抗炎、免疫抑制作用，可抑制系膜細(xì)胞的增生，改善腎小球基底膜電荷狀態(tài)抑制蛋白排出，減輕腎小球纖維化。
　　3. TGF-β1及其活化的NF-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路共同介導(dǎo)ECM的合成，而且其又協(xié)同促進(jìn)IV型膠原（COL-IV）、纖連蛋白（FN）及層粘連蛋白（LN）合成，共同介導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。
　　4. TWP