膜蛋白Tmem235在癲癇模型中的表達(dá)分析.pdf

1、癲癇（Epilepsy）是由多種原因引起的腦部神經(jīng)元陣發(fā)性異常放電所致的非傳染性神經(jīng)疾病，影響著數(shù)以百萬計人們的日常生活。癲癇的發(fā)生通常是由于大量神經(jīng)元突然異常放電導(dǎo)致大腦神經(jīng)元興奮性失調(diào)，因此，癲癇的發(fā)生通常與大腦內(nèi)的信號傳遞有關(guān)。大腦中的信號傳遞方式包括電傳導(dǎo)和化學(xué)傳導(dǎo)，化學(xué)傳導(dǎo)通常在細(xì)胞膜之間進行，通過囊泡或離子通道進行化學(xué)物質(zhì)的傳遞，達(dá)到傳遞興奮或抑制的目的。因此癲癇的機制研究常常與傳遞信號的跨膜區(qū)域有密切的關(guān)系。早有研究通過生

2、物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)Tmem235編碼的跨膜蛋白與鈣離子通道存在同源關(guān)系，與此同時，通過基因芯片篩選到Tmem235基因在癲癇疾病中可能有所改變，因此Tmem235可能參與了癲癇疾病的發(fā)生和機制。
　　本研究首先通過RT-PCR得到帶酶切位點的Tmem235抗原決定簇的雙鏈DNA，接著對回收到的Tmem235和pet32a進行雙酶切，將酶切成功的Tmem235和pet32a片段連接，連接成功后轉(zhuǎn)化，通過凝膠電泳初步挑選陽性克隆，再送

3、去測序，通過VECTOR NT比對確定為正確的Tmem235和pet32a的連接序列。將正確的連接序列培養(yǎng)擴增然后經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到大量的Tmem235蛋白，將誘導(dǎo)后的蛋白進行超聲破碎，然后通過Tricine-SDS-PAGE確定蛋白的表達(dá)位置，最后以Tricine-SDS-PAGE膠分離得到純化的Tmem235，免疫兔子得到Tmem235的抗體。首先利用PCR和Western Blot對大鼠的不同組織的Tmem235進行半定量實

4、驗，分析Tmem235的組織特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tmem235在肝、脾中有微量表達(dá)，在腦組織中的表達(dá)較為豐富。接著，我們通過持續(xù)每天注射戊四唑建立起穩(wěn)定的癲癇點燃模型，分別提取癲癇動物模型和正常大鼠的海馬和皮層的RNA和蛋白質(zhì)，通過PCR和Western Blot對其進行mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)分析。實驗發(fā)現(xiàn)，癲癇動物模型的皮層在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)均較正常鼠上調(diào)。Tmem235在癲癇動物中的差異表達(dá)對我們研究癲癇疾病的病理原