溶酶體膜蛋白TMEM192在肝癌細(xì)胞HEPG2中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上第5大常見癌癥，占原發(fā)性肝癌的90％。在我國，HCC是最為常見的惡性腫瘤之一，其相關(guān)死亡率排名第二，僅次于肺癌。導(dǎo)致肝癌的高危環(huán)境因素主要是HBV和HCV病毒感染。在世界范圍內(nèi)因此原因而導(dǎo)致肝癌的占到肝癌發(fā)病總數(shù)80％之多。當(dāng)然這其中還包括其他的病毒感染。近年來有研究報(bào)道，吸煙和酗酒也是肝癌的高危因素，并且在一些分子病中其患病的風(fēng)險(xiǎn)大大提升，比如血色素病，wils

2、on病等。
　　 自噬是細(xì)胞的代謝方式之一，是指在饑餓條件下，細(xì)胞通過蛋白的降解，使細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)和細(xì)胞器得以循環(huán)利用。有研究結(jié)果表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而自噬在腫瘤細(xì)胞中也起著或者促進(jìn)細(xì)胞死亡或者維持細(xì)胞存活的作用。自噬是如何發(fā)揮這些作用的目前也還不清楚。本研究以新的溶酶體膜蛋白TMEM192為切入點(diǎn)，從基因?qū)用嫜芯科鋵?duì)肝癌細(xì)胞的狀態(tài)、信號(hào)通路、標(biāo)志物的影響，進(jìn)一步推測(cè)其可能的作用機(jī)制。期待可以發(fā)現(xiàn)肝癌預(yù)防和治療的

3、新的突破點(diǎn)。
　　 第一部分，TMEM192生物信息學(xué)分析和內(nèi)源性分布及亞細(xì)胞定位
　　 目的:
　　 在本部分，我們首先通過較全面的生物信息學(xué)分析來對(duì)TMEM192的氨基酸序列進(jìn)行了分析，對(duì)它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并在此基礎(chǔ)上推測(cè)其可能具有的功能。并利用多種方法和證據(jù)進(jìn)一步明確TMEM192是位于溶酶體的膜蛋白。同時(shí)對(duì)它的組織特異性分布進(jìn)行研究。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用可以連接國際互聯(lián)網(wǎng)的電子計(jì)

4、算機(jī)。從NCBI查獲的人類TMEM192及鼠源Tmem192的全長(zhǎng)氨基酸片段序列，并在專業(yè)的網(wǎng)站上對(duì)該基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。
　　 2.免疫熒光染色:為了證實(shí)TMEM192的亞細(xì)胞定位，分別利用溶酶體標(biāo)志蛋白LAMP1(lysosomeassociatedmembraneprotein1)抗體，與特異性anti-TMEM192抗體對(duì)爬片細(xì)胞進(jìn)行雙染色標(biāo)記。將單層爬片生長(zhǎng)的細(xì)胞先于固定液中固定，接著孵育一抗，再孵育連接熒光的二抗，

5、在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):在TRIzol提取總RNA后，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBRGreen(I)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各個(gè)組織TMEM192的組織分布情況，以及在各個(gè)細(xì)胞株的表達(dá)。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線和凝膠電泳雙重確認(rèn)，采用2-△△ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)須重復(fù)三次。
　　 4.Westernboltting分析:提取組織內(nèi)的蛋白后進(jìn)行定量分析，然后經(jīng)過電泳

6、，轉(zhuǎn)膜，以及免疫雜交，最后發(fā)光顯影，進(jìn)行結(jié)果分析。
　　 5.RT-PCR:檢測(cè)各個(gè)組織及各細(xì)胞系的TMEM192表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.TMEM192的生物信息學(xué)分析
　　 (1)通過查找TMEM192的基因序列并做生物的信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)人類TMEM192基因定位于第4號(hào)染色體(165，997，256-166，034，071)，編碼區(qū)全長(zhǎng)4516堿基，含有6個(gè)外顯子，編碼271個(gè)氨基酸的蛋白

7、質(zhì)，分子量30KDa。其氨基酸序列如圖1-1A所示。小鼠Tmem192基因定位于8號(hào)染色體(67，471，084-67，492，933)，編碼區(qū)全長(zhǎng)1123堿基，含有4個(gè)外顯子，編碼266個(gè)氨基酸序列的蛋白質(zhì)，分子量約30KDa(圖1-1B)。通過NCBI的BLAST比對(duì)工具比對(duì)發(fā)現(xiàn)人源和鼠源的蛋白質(zhì)序列具有高度的一致性，相似性達(dá)95％。
　　 (2)由信號(hào)肽分析軟件分析可知，該蛋白質(zhì)存在信號(hào)肽的可能性較小。由在線軟件分析可知(

8、如下所示)，TMEM192的疏水性較強(qiáng)，最大值達(dá)到3.000，且位于N端最小值為-2.500(圖1-4)。通常疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)常分布于內(nèi)膜系統(tǒng)，胞內(nèi)水溶性較低，提示具有較重要的生物學(xué)作用。
　　 (3)由分析結(jié)果得知，TMEM192含有6個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，TMEM192至少存在2個(gè)N末端的糖基化位點(diǎn)。TMEM192至少存4個(gè)以上的跨膜螺旋序列(H表示)，這表明可能是膜上的受體或者定位于膜上。
　　 2.免疫熒光染色:

9、綠色熒光顯示的區(qū)域?yàn)門MEM192抗體標(biāo)記。TMEM192顯示為小點(diǎn)狀綠色信號(hào)，分布于細(xì)胞漿內(nèi)核周區(qū)域。膜上和核區(qū)域未見有綠色熒光信號(hào)。這表明TMEM192定位于細(xì)胞質(zhì)中。與anti-LAMP1共染色(紅色熒光部分)，我們發(fā)現(xiàn)TMEM192與LAMP1共定位特征，呈現(xiàn)雙通道融合后的橘黃色信號(hào)特征。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR:為了研究TMEM192的組織分布特性，我們以小鼠的組織為研究對(duì)象，觀察TMEM192在小鼠組織的表達(dá)特

10、性。通過定量PCR分析表明TMEM192mRNA在小鼠心、腎、肝及胰腺組織有較高的表達(dá)。而在其它組織如皮膚、脾臟、脂肪、小腸等組織及器官，TMEM192的mRNA表達(dá)量相對(duì)較低或甚少。
　　 4.Wesrenblotting:用商業(yè)化的抗TMEM192多克隆抗體，我們通過對(duì)上述組織的蛋白提取物進(jìn)行Westernblotting分析，得到了較好的結(jié)果，TMEM192蛋白在肝臟、心臟、腎臟等臟器及組織具有高豐度的表達(dá)，而在皮膚、睪丸

11、及肺臟等器官和組織其蛋白質(zhì)豐度相對(duì)較低或缺乏。
　　 5.RT-PCR:在觀察TMEM192的組織學(xué)分布時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)了TMEM192相對(duì)于正常細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)，我們利用普通RT-PCR技術(shù)，重復(fù)的觀察到了這一結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　　 (1)TMEM192存在于人類基因定位于第4號(hào)染色體的一個(gè)高度保守的基因，含有2個(gè)N末端的糖基化位點(diǎn)，6個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)以上的跨膜螺旋序列的一個(gè)膜蛋白。
　

12、　 (2)TMEM192是一個(gè)酶體膜蛋白，他和溶酶體標(biāo)志蛋白LAMP1具有共定位特稈。
　　 (3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，TMEM192在小鼠心、腎、肝及胰腺組織有較高的表達(dá)。而在其它組織如皮膚、脾臟、脂肪、小腸等組織及器官，TMEM192的mRNA表達(dá)量相對(duì)較低或甚少。
　　 (4)Westernblotting分析發(fā)現(xiàn)TMEM192蛋白在肝臟、心臟、腎臟等臟器及組織具有高豐度的表達(dá)，而在皮膚、睪丸及肺臟等器官和組

13、織其蛋白質(zhì)豐度相對(duì)較低或缺乏。
　　 (5)TMEM192相對(duì)于正常細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)。
　　 第二部分，TMEM192在肝癌細(xì)胞HepG2中的作用及其機(jī)制
　　 目的:
　　 在本部分研究中，我們進(jìn)行了p-CMV-C-TMEM192-flag真核表達(dá)載體的構(gòu)建，觀察其在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響。同時(shí)利用RNA干擾技術(shù)把TMEM192-siRNA成功轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，達(dá)到沉默T

14、MEM192的表達(dá)后，進(jìn)而分析TMEM192缺失后對(duì)腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系的影響。
　　 方法:
　　 (1)將TMEM192逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)物克隆入真核表達(dá)載體pCMV-C-Flag，經(jīng)酶切、PCR鑒定及測(cè)序分析，構(gòu)建pCMV-C-TMEM192-Flag真核表達(dá)載體。
　　 (2)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒pCMV-C-TMEM192-FlagDNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察其表達(dá)

15、。
　　 (3)在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)后觀察對(duì)其生長(zhǎng)和增值的影響。
　　 (4)利用RNA干擾技術(shù)將針對(duì)人TMEM192基因設(shè)計(jì)的siRNA序列用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞的凋亡，以及westernblot分析各相關(guān)基因的蛋白表達(dá)。
　　 (5)利用ATG7-siRNA誘導(dǎo)ATG7沉默后觀察，在HepG2細(xì)胞阻斷自噬

16、途徑是否能影響TMEM192-siRNA誘導(dǎo)的凋亡。進(jìn)而推測(cè)TMEM192在這一過程中的可能的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 (1)重組真核表達(dá)載體pCMV-C-TMEM192-Flag已成功載入TMEM192的全長(zhǎng)編碼基因(除終止密碼子外)，序列測(cè)定的結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致。外源性表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 (2)熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)染pCMV-C-TMEM192-flag融合基因的HepG2細(xì)胞中存在熒光分布，

17、轉(zhuǎn)染成功。
　　 (3)在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)TMEM192后，對(duì)于HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)和增值并無顯著的影響。
　　 (4)TMEM192-siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)TMEM192基因表達(dá)沉默后，LC3的鏈接磷酸化被激活，同時(shí)Bax，caspase-3的表達(dá)升高，p38-MAPK磷酸化而激活。
　　 (5)在對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)的TMEM192-siRNA干擾后，接著通過自吞噬的關(guān)鍵基因ATG7

18、-siRNA處理細(xì)胞，沉默ATG7表達(dá)后發(fā)現(xiàn)能明顯抑制在HepG2細(xì)胞的凋亡。并且在此過程中，我們也一并觀察到Caspase-12、Bax及Caspase-3蛋白同時(shí)受到明顯抑制。
　　 結(jié)論:
　　 (1)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-C-TMEM192-Flag。
　　 (2)pCMV-C-TMEM192-Flag轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，過表達(dá)TMEM192后對(duì)細(xì)胞并無顯著的影響。
　　 (3)TME