N-乙酰半胱氨酸通過miR-141改善慢性前列腺炎癥狀的機制研究.pdf

1、慢性非細菌性前列腺炎（Chronic Abacterial Prostatitis，CP）/慢性骨盆疼痛綜合征（chronic pelvic pain syndrome，CPPS）（NIH-III類）是泌尿外科很常見的臨床疾病，在男性人口中的發(fā)病率為5％-10%。該病通常表現(xiàn)為尿路刺激癥狀、骨盆區(qū)酸痛和性功能障礙等，有時甚至合并精神心理癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和家庭穩(wěn)定。臨床CP/CPPS的治療是困擾泌尿外科醫(yī)師的難題之一。由于CP

2、/CPPS病因的多變性和復雜性，其治療方法也表現(xiàn)多樣性，目前已有的CP/CPPS的治療方法，如抗生素、非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、α-受體阻斷劑、植物制劑、盆底物理治療和認知行為療法等。至今尚無統(tǒng)一、有效的治療方法。因此，其病理機制一直是臨床醫(yī)師和研究學者關(guān)注和研究熱點。研究報道表明，前列腺炎患者氧化應(yīng)激水平升高，而給予抗氧化應(yīng)激和抗炎性的藥物，可以改善模型動物的前列腺炎病理狀態(tài)。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，N

3、AC），作為一種含硫醇系抗氧化劑，通過氧化劑的清理或增強谷胱甘肽過氧化物酶的催化活性或上調(diào)抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶，從而降低氧化應(yīng)激活性。然而，NAC是否適用于慢性前列腺炎的治療尚未見報道。從病理學機制的角度講，NAC在其它組織、細胞中的抗細胞和組織氧化或炎性的生物效應(yīng)是通過調(diào)節(jié)性非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNAs）或細胞氧化相關(guān)信號通路表達實現(xiàn)的。
　　隨著基因組研究，發(fā)現(xiàn)全基因組98%的DNA序列被轉(zhuǎn)

4、錄，但編碼蛋白質(zhì)的基因序列不足2%。而非編碼RNAs（non-coding RNA，ncRNAs）通過調(diào)控蛋白質(zhì)的表達參與生命體的生長、分化、增殖和凋亡等過程。microRNAs（miRNAs）是哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的一種調(diào)節(jié)性 ncRNAs，其大小為18~25nt，可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控模式調(diào)控靶基因的表達。因此異常表達的miRNAs往往是導致疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。miRNAs與前列腺疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)性已有報道，可以調(diào)控前列腺癌細胞的增殖、遷移

5、和侵襲能力。目前一些存在于人體液中的細胞外 miRNAs確定為疾病發(fā)生的標志物。miR-141是前列腺疾病發(fā)生的指示分子，尤指前列腺癌。然而，miR-141表達異常是否與慢性非細菌性前列腺炎的發(fā)生有關(guān)，尚未見報道。
　　另外，miR-141屬于miR-200A-3p/141-3p家族，而miR-200A-3p/141-3p家族被發(fā)現(xiàn)與KELCH狀的ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein

6、1，Keap1的）mRNA的3’-UTR有結(jié)合位點。Keap1是核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2（NF-E2-related factor，Nrf2）相關(guān)因子2的負調(diào)節(jié)蛋白，而Keap1和Nrf2組成了調(diào)控細胞和組織抗氧化過程的一個重要信號通路。miR-141是否通過直接靶向調(diào)控Keap1，以及影響Keap1/Nrf2信號通路所調(diào)控的抗氧化通路，參與NAC的抗前列腺炎效應(yīng)是本課題要解決的關(guān)鍵科學問題。
　　因此，本課題通過四個部分進行研究：第一

7、部分通過臨床樣本分析，探討miR-141異常表達和慢性非細菌性前列腺炎發(fā)生的相關(guān)性；第二部分通過建立大鼠前列腺炎模型，探討 N-乙酰半胱氨酸改善大鼠前列腺炎疼痛和炎性癥狀的作用及可能的機制；第三部分研究miR-141調(diào)控人前列腺上皮細胞RWPE-1的Keap1表達；第四部分通過miR-141 inhibitor和N-乙酰半胱氨酸共同治療前列腺炎的療效分析。
　　目的：探討NAC抗前列腺炎的效應(yīng)及其可能通過的機制
　　方法：①

8、收集蘇州大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科診治的60例臨床III型前列腺炎患者的前列腺液，通過實時定量PCR檢測miR-141表達變化。
　?、谛坌許D大鼠隨機分為三組：對照組（n=20），λ-角叉菜膠誘導的慢性非細菌性前列腺炎（CAP）模型組（n=20），NAC注射液治療λ-角叉菜膠引起的CP/CPPS組（n=20）。以眼睛關(guān)閉分數(shù)，運動活力分數(shù)指示CP/CPPS動物疼痛程度。CP/CPPS動物的炎性狀態(tài)指標是炎癥細胞計數(shù)、組織特異性炎性

9、分子環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達和Evans blue血漿滲漏量。Keap1/Nrf2以及Nrf-2下游分子NQO1、GST和HO-1等蛋白表達通過蛋白免疫印跡方法檢測。
　?、弁ㄟ^建立人前列腺上皮細胞RWPE-1 miR-141過表達或抑制表達細胞系，熒光素酶報告分析檢測Keap1 mRNA的3’-UTR的轉(zhuǎn)錄活性，探討miR-141對Keap1的表達調(diào)控。
　　④建立miR-141 i

10、nhibitor尾靜脈注射和NAC共同治療CP/CPPS模型，通過檢測模型動物的炎性狀態(tài)和疼痛狀態(tài)（眼睛閉合程度和運動活力），以及Nrf2下游分子的表達情況，觀察miR-141在NAC抗前列腺炎效應(yīng)中的作用。
　　結(jié)果：
　?。?）與健康者相比，慢性非細菌性前列炎 IIIA和 IIIB患者的前列腺分泌液中miR-141表達水平下降。
　?。?）角叉菜膠-慢性非細菌性前列腺炎模型動物表現(xiàn)出疼痛（眼睛閉合分數(shù)增加和運動活力

11、降低）、炎性反應(yīng)（炎性細胞數(shù)量增加和COX-2表達上調(diào)）和神經(jīng)源性血漿Evans blue滲透量增加。
　?。?）與臨床檢測結(jié)果相似，角叉菜膠-慢性非細菌性前列腺炎模型動物的前列腺分泌液中miR-141表達水平下降。
　　（4）NAC注射后，模型動物的前列腺疼痛反應(yīng)和炎性細胞浸潤均有所減輕， Evans blue滲透量減少。
　?。?）與此同時，NAC注射后，促進了miR-141表達，同時逆轉(zhuǎn)了非細菌性前列腺炎引起的K

12、eap1/Nrf2信號通路的激活，導致Nrf2下游的氧化應(yīng)激相關(guān)酶NQO1、GST和HO-1的表達上調(diào)。
　?。?）甲基化特異性PCR結(jié)果顯示，模型動物前列腺組織中miR-141啟動子甲基化水平顯著上調(diào)，而NAC注射治療后可以顯著抑制miR-141啟動子甲基化。
　?。?）熒光素酶基因報告分析結(jié)果顯示，miR-141可以調(diào)控Keap1mRNA的3’-UTR的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控Keap1蛋白表達。
　?。?）miR-14