N-乙酰半胱氨酸對模擬失重肺炎大鼠的保護性研究.pdf

1、目的:
　　在失重或模擬失重狀態(tài)下,機體的免疫功能降低,肺功能受損,抗感染能力降低,易于發(fā)生呼吸系統(tǒng)損傷和感染。N-乙酰半胱氨酸是臨床上常用的祛痰藥物,并具多種藥理作用,如免疫調節(jié),抑制炎癥反應,抑制細菌及生物被膜生成的作用。本實驗采用最常用、最成熟的模擬失重方法即大鼠尾吊法,并在此基礎上制造肺部感染模型,加入N-乙酰半胱氨酸藥物干預。探索在模擬失重狀態(tài)下,N-乙酰半胱氨酸對肺炎鏈球菌性肺炎的保護性作用,對失重狀態(tài)肺臟的保護,及進

2、一步驗證機體在失重狀態(tài)下抗感染能力降低。通過觀察大鼠感染肺炎鏈球菌后的肺組織病理結構改變,血液標本中炎癥指標的變化等,為失重狀態(tài)下呼吸系統(tǒng)的損傷及感染的藥物治療及防護提供理論依據,為航天醫(yī)療保障提供依據。
　　1.建立模擬失重大鼠肺部感染模型:健康清潔級雄性Wistar大鼠32只(北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證編號:SCXK京2013-0007),體重為(270±20)g,按照隨機數字表法分為4組:A組(尾吊灌藥注菌組

3、)、B組(尾吊灌藥未注菌組)、C組(尾吊未灌藥注菌組)、D組(尾吊未灌藥未注菌組)。每組8只。實驗第1天稱重,注藥組給予N-乙酰半胱氨酸(富露施300mg/kg2d)灌胃,對照組給予每天注射用無菌用水1ml灌胃。實驗第2天按照陳杰等方法建立尾吊大鼠模型:每個鼠籠內尾吊1只大鼠,使大鼠前肢踏于籠底,尾部懸于籠頂,后肢懸空完全解除負荷,身體縱軸與水平面約成30°。實驗環(huán)境為室溫(22℃),晝夜周期均為12h,實驗過程中所有大鼠可以自由進食、

4、飲水。注菌組(肺炎鏈球菌標準菌株 ATCC6303)于實驗第5d采用張均田氣管插管法經氣管注入0.4ml(細菌濃度約為93108CFU/ml)菌懸液,給以對照組注射0.4ml的0.9％生理鹽水。大鼠共尾吊7天,于第9天取材。具體方法為:用2%戊巴比妥鈉按50mg/kg腹腔內注射麻醉,麻醉后將大鼠仰臥固定于實驗臺,并使其實驗臺(大鼠頭部)與水平面保持約30°,用自制開口器將大鼠口腔撐開,充分暴露咽喉部,采用自制的直徑約1mm的金屬鈍針管經

5、口緩慢插入氣管,當進入過程中鈍針接近支氣管位置。用1ml無菌注射器吸取細菌懸液0.4ml,經鈍針管緩慢注入氣管內,此時將實驗臺垂直豎起并保持約1min,使氣管內菌懸液由于重力作用流入大鼠的支氣管和肺泡內;未注菌組在第5天注入0.4ml的0.9%無菌生理鹽水。第9天處死實驗大鼠,并進行肺組織病理顯微結構觀察及細菌學鑒定,確定肺炎模型制備成功。
　　2.肺炎鏈球菌菌懸液的配制:(ATCC6303,購自上海市米寶萊科技有限公司)。按照操

6、作說明書將細菌復蘇后轉入血培養(yǎng)瓶中于37℃恒溫,5%CO2培養(yǎng)箱中增菌保存。用無菌注射器吸取1 ml增菌培養(yǎng)后的菌液放入離心管中,11000r/min,高速離心5min,棄去上清液,將白色細菌沉淀用0.45%無菌生理鹽水配成細菌懸液,用簡易細菌濃度測定儀配制所需濃度待用。
　　3.血標本處理:2%戊巴比妥鈉按60 mg/kg將大鼠腹腔注射麻醉,麻醉成功后腹主動脈取血,4小時內進行血常規(guī)測定。全血標本處理方法:取2個離心管,分別標記

7、為標記管、空白對照管,分別加入1ml分離液,取1ml新鮮肝素抗凝血,與全血及組織稀釋液1:1混勻后小心加于分離液之上;以2000轉/分(半徑15cm水平轉子)離心30分鐘,此時離心管中由上至下細胞分為四層。取第三層、第四層,放入盛有2ml細胞洗滌液的試管中,充分混勻后,以2000轉/分離心30分鐘,棄去上清液,加入紅細胞裂解液,以2000轉/分離心5分鐘,棄去紅色上清,加入適量PBS溶液,重懸沉淀,重復洗滌1次。分離率為80%以上。1m

8、lPBS溶液配成中性粒細胞懸液,取500ul的中性粒細胞懸液,在標記管中加入1ul Anti-Rat Granulocyte Marker FITC,5ul Anti-Rat CD11b/c PE充分混勻,在空白對照管中加入1ul Anti-Rat Granulocyte Marker FITC,5ul Mouse IgG2a K Isotype ControI PE,室溫避光20分鐘,上機檢測。取剩余500 ul的中性粒細胞懸液室溫2

9、000轉/分離心,棄去上清液,加入1ml配好的DCFH-DA避光37℃水浴40分鐘。室溫2000轉/分離心,去上清液,用PBS洗滌2次后重懸,配成500ul的細胞懸液,將流式細胞儀(美國BD公司)按激發(fā)波長502nm,發(fā)射波長530nm調好后,進行檢測。
　　4.肺組織病理顯微結構觀察用2%戊巴比妥鈉按60 mg/kg將大鼠腹腔注射麻醉,每只取右肺上葉組織,經4%多聚甲醛固定,脫水,包埋,切片,脫蠟,HE染色,光學顯微鏡觀察。

10、r>　　結果:
　　1.大鼠肺臟組織病理顯微結構改變:C組肺組織淤血明顯,肺泡大小不一致,支氣管周圍致密淋巴細胞浸潤嚴重,肺泡間隔增寬增厚病變范圍較大,小靜脈及毛細血管擴張淤血,間質內大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤明顯,灶性肺泡腔內充滿泡沫細胞。A組也可見部分上述改變,但炎癥反應程度較輕。D組肺組織淤血,肺泡大小不一,肺泡間隔增寬,小靜脈及毛細血管擴張充血,間質內可見少許淋巴細菌、中性粒細胞浸潤。B組僅部分肺組織出現上述改變,但較D

11、組輕。
　　2.注菌組大鼠(A、C組)均從肺組織和肺泡灌洗液中培養(yǎng)出同種的肺炎鏈球菌,并在血瓊脂平板上的生長。B、D未注菌組,從肺組織和肺泡灌洗液中未培養(yǎng)出細菌生長。
　　3.A、C組較B、D組中性粒細胞百分比升高,CD11b值,DCFH-DA值升高,IL-10、IL-6測定值升高,以C組最為明顯。并具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:模擬失重狀態(tài)下機體免疫功能降低,抗感染能力降低,肺部感染的炎癥反應增強,病理損傷更加嚴重。N