PEI-pOPG-PLGA芯-殼型基因活化基質(zhì)的制備及其相關(guān)研究.pdf

1、牙周病是一種常見和多發(fā)的口腔慢性疾病。在徹底清除了牙周組織感染的基礎(chǔ)上，利用生物膜引導(dǎo)牙周組織再生是目前國內(nèi)外用來治療牙周病最常用的方法。但是牙周支持骨組織的重建是一個復(fù)雜的過程，如何使缺失的骨組織再生及恢復(fù)，在世界范圍仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。傳統(tǒng)的引導(dǎo)骨組織再生術(shù)中的所采用的生物膜多數(shù)只能起到物理屏障作用，對于誘導(dǎo)牙周組織修復(fù)與再生存在一定的局限性。基因活化基質(zhì)（gene activated matrix,GAM）作為一種新的組織

2、工程方法，將生物支架材料和質(zhì)粒載體相結(jié)合，形成了一種基因局部釋放系統(tǒng)。相比直接使用外源性生長因子，GAM支架內(nèi)基因表達所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有相對較低的成本和長期效應(yīng)，因此其相關(guān)的制備與研究越來越成為關(guān)注的熱點。
　　骨的重建修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，是骨的生成與吸收同時存在的動態(tài)過程。骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)在破骨細(xì)胞的發(fā)生、分化中起核心作用，不但能夠通過抑制破骨細(xì)胞的分化及活性來抑制骨組織的吸收過程，還可以通過

3、誘導(dǎo)堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)的形成來促進成骨，從促進生成和抑制吸收兩方面促進骨組織的修復(fù)重建。
　　通過靜電紡絲技術(shù)制備的生物支架材料，其結(jié)構(gòu)具有類似于細(xì)胞外基質(zhì)的自然形態(tài)，具有超細(xì)直徑和較大比表面積的特點；有利于細(xì)胞遷移和組織的生長、營養(yǎng)物質(zhì)的攝入和代謝廢物的排放。同軸靜電紡絲技術(shù)可以分別將兩種物質(zhì)置于纖維的芯層和殼層，避免了殼層的有機物與芯層的生物活性物質(zhì)的直接接觸，保存了生物分子的活性。因此同軸靜電紡絲技術(shù)被廣泛的用于生物活性支

4、架的制備。
　　目的：
　　通過同軸靜電紡絲技術(shù)，制備以聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）包裹的骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)質(zhì)粒微球為芯層，以聚乳酸－羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)為殼層的PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM；檢測GAM纖維的微觀形貌、力學(xué)性能以及OPG基因的釋放速度，通過細(xì)胞實驗和動物實驗檢測這種載OPG基

5、因GAM的生物相容性、基因轉(zhuǎn)染效率、表達以及成骨情況。
　　方法：
　　1、雙酶切制備載體，釣取并擴增目的片段，構(gòu)建pDsRed2-N1-hOPG重組質(zhì)粒，經(jīng)過PCR和基因測序鑒定質(zhì)粒。最后大量擴增、提取重組質(zhì)粒。
　　2、采用同軸靜電紡絲方法制備PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM，并檢測了芯-殼型纖維的表面形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及力學(xué)和緩釋性能。
　　3、將牙周膜干細(xì)胞與PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM

6、共培養(yǎng)后，通過MTT實驗檢測GAM的細(xì)胞毒性；激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測OPG基因?qū)ρ乐苣じ杉?xì)胞的轉(zhuǎn)染情況；通過RT-PCR和Western Blot檢測OPG的表達情況；利用破骨細(xì)胞分化抑制實驗檢測OPG的活性。
　　4、構(gòu)建SD大鼠顱骨極限缺損模型，植入PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM，飼養(yǎng)8周后處死，通過Micro-CT重建與測量以及組織學(xué)切片染色來研究PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM在組織內(nèi)誘導(dǎo)成骨的

7、情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功雙酶切GV147質(zhì)粒載體，PCR技術(shù)釣取出目的基因片段，大小為1245bp，與質(zhì)粒載體進行成功重組后，獲得后續(xù)實驗需要的重組質(zhì)粒pDsRed2-N1-hOPG。并通過PCR以及基因測序證實了所構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。最后通過大腸桿菌成功擴增并提取了大量高純度的重組質(zhì)粒。
　　2、利用同軸靜電紡絲技術(shù)制備出的PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM具有光滑表面，納米級的纖維直徑，透射電鏡下可檢測

8、到處于芯層的OPG質(zhì)粒微球。該PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM具有合適的力學(xué)性能，以及超過30天的穩(wěn)定緩釋性能。
　　3、PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM經(jīng)過與牙周膜干細(xì)胞共同培養(yǎng)后，MTT測試發(fā)現(xiàn)其基本沒有細(xì)胞毒性，并表現(xiàn)出高達90％的轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR及WB檢測后發(fā)現(xiàn)，OPG質(zhì)粒從PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM釋放后能夠轉(zhuǎn)染進入目的細(xì)胞內(nèi)，并能夠在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達；經(jīng)過誘導(dǎo)RAW264.7分化破骨細(xì)

9、胞抑制實驗我們發(fā)現(xiàn)，該PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM表達的OPG蛋白能夠明顯抑制破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的發(fā)生。
　　4、GAM植入SD大鼠顱骨極限缺損模型8周后，切口均愈合良好。經(jīng)過Micro-CT重建與測量后發(fā)現(xiàn)SD大鼠顱骨極限缺損重建了40%，和組織切片染色的結(jié)果一致，表明PEI/pOPG-PLGA芯-殼型GAM可以提高大鼠顱骨骨缺損的重建修復(fù)速度。
　　結(jié)論：
　　本研究通過同軸靜電紡技術(shù)成功制備出芯層為以 P